В последнее время практическая медицина обогатилась значительным числом молекулярно-генетических диагностических методов, что связывают с осуществлением проекта «Геном человека» — геномные (постгенеомные) технологии. Интерес к методам молекулярно-генетического анализа людей (ДНК-диагностика) стимулируется осознанием того, что непременное условие повышения эффективности профилактических, превентивных и терапевтических медицинских (здравоохраненческих) мероприятий — информация о генетической конституции отдельных лиц (см. предисловие: геномное тестирование или портретирование) и об особенностях гено(аллело)фондов человеческих популяций или иных групп населения. Этим в немалой степени объясняется «бум» в области биомедицинских исследований, направленных на поиск диагностических и прогностических маркеров (в том числе генетических) распространенных и «грозных» патологических состояний, в частности онкологических.
Нельзя забывать о таких генетических явлениях, как генокопиро-вание и фенокопирование, неполная экспрессивность и пенетрант-ность, генетическая гетерогенность (см. п. 4.3.1.1), затрудняющих диагностику многих наследственных болезней. К примеру, моногенное наследственное заболевание «муковисцидоз» (кистозный фиброз поджелудочной железы), по распространенности занимающее первое место в группе аутосомно-рецессивных болезней человека, обусловлено мутациями в разных частях гена, картированного на длинном плече хромосомы 7 (7q31.2). У 50-70\% пациентов мутация представлена делецией трех нуклеотидов в 10-м экзоне гена — delF508. Фенотипиче-ский эффект мутации состоит в отсутствии в кодируемом полипептиде (всего 1480 аминокислот) в 508-м положении аминокислоты фенила-ланина. Названный полипептид участвует в обеспечении функции хлор-натриевого чрезмембранного транспортного канала в железистых экзокринных клетках. К настоящему времени известно порядка 600 (по другим источникам, 800) мутаций гена, приводящих к муковисцидозу (часть пациентов несет одновременно две мутации — генетические компаунды). Из нескольких сотен мутаций клинический интерес представляют порядка шести, так как именно они являются причиной развития патологического фенотипа (т.е. заболевания) у 70\% пациентов. При синтезе железистыми клетками бронхов, поджелудочной железы и эпителиальной выстилки кишечника, слизистой оболочки придаточных па-
зух носа и других органов мутантного полипептида повышается вязкость образуемого ими слизистого секрета. Это приводит к закупориванию путей оттока слизи и развитию воспаления. Диагноз может быть поставлен на основании клинической картины, в которой сочетаются симптомы поражения бронхолегочного аппарата, кишечные расстройства, признаки дисфункции поджелудочной железы, а также на основании данных лабораторных исследований, в частности, если в поте обнаруживается ненормально высокая (свыше 60 ммоль/л) концентрация хлоридов. Установлена определенная зависимость тяжести заболевания от типа мутации, которая его вызвала. Сейчас методами ДНК-диагностики тип мутации, приводящей к муковисцидозу, определяется с надежностью в 72\%, т.е. диагностическая эффективность (информативность) не достигает желаемых 100\%. Предположительно, одна из причин состоит в многочисленности мутаций гена, приводящих к соответствующему патологическому фенотипу (т.е. к болезни). Показатели эффективности ДНК-диагностики различны для разных заболеваний. В случае ахон-дроплазии и хореи Гентингтона, например, они достигают 100\%, тогда как в случае миодистрофии Дюшена — 60\%.
Различают прямые и косвенные методы ДНК-диагностики. Первые применяются, если известны: ген, ответственный за развитие соответствующего наследственного заболевания, основные типы его патологических (патогенных) мутаций — в случае муковисцидоза наиболее частая (мажорная) мутация — delF508 (см. здесь же, выше).
В настоящее время приоритетная роль в качестве основы ДНК-диагностики переходит к методу ПЦР (Полимеразная Цепная Реакция), или PCR (англ. Polymerase Chain Reaction). Названный метод дает возможность в условиях in vitro в течение 1 ч получить миллионы копий заданного (представляющего интерес для исследователя или врача) фрагмента молекулы (нуклеотидной последовательности) ДНК, использование которых благодаря их многочисленности существенно облегчает идентификацию в геноме пациента (пробанда) сайта ДНК, представляющего диагностический интерес. Популярность метода ПЦР в медицинской среде объясняется также тем, что он широко используется в целях высокоточной и надежной диагностики вирусных (СПИД, вирусные гепатиты) и инфекционных заболеваний по выявлению нуклеиновой кислоты возбудителя.
Альтернативным методу ПЦР, уступающим ему позиции в качестве основы ДНК-диагностики, является метод блот-гибридизации (от англ. blot — пятно, клякса; blotting paper — промокашка, фильтроваль-
ная бумага). В арсенале молекулярных и медицинских генетиков этот метод появился раньше метода ПЦР. Технически он более сложен, требует использования радиоактивных материалов. В настоящее время его модификации применяются для решения ряда конкретных задач — гибридизация ДНК-зондов с разделенными с помощью электрофореза молекулами РНК, а также с белковыми молекулами, фиксируемыми на фильтрах с мечеными антителами.
Косвенные методы ДНК-диагностики наследственных (прежде всего, моногенных) болезней (в общем виде молекулярно-генетические методы генетического анализа людей — см. здесь же, выше) основаны на идентификации не патологических (патогенных) мутаций генов непосредственно, а на анализе наличия в геноме и поведения (распределение аллелей генетического маркера в геномах родственников: у сибсов, в парах «дед-внук», «дядя-племянник») в семье обследуемого так называемых полиморфных генетических маркеров — участков (ло-кусов) ДНК, тесно сцепленных в соответствующем районе конкретной хромосомы с локусом, ответственным за генетическое заболевание. На настоящий момент на хромосомах человека картировано порядка 6 тыс. таких ДНК-маркеров (полиморфных генных локусов). Для некоторых из них доказана ассоциация с конкретным наследственным или мульти-факторным заболеванием. Так, аллель В27 генетической системы HLA ассоциирован с «анкилозирующим спондилитом» и «псориатическим спондилитом», аллель DR3 названной системы — с болезнью Аддисона и с рассеянным склерозом, аллель DR4 — с ревматоидным артритом, аллель CW6 — с псориазом.
Применение косвенных методов ДНК-диагностики возможно при отсутствии полной информации о «проблемном» гене (он не идентифицирован и поэтому не известен порядок следования в нем нуклеотидных последовательностей, т.е. ген не секвенирован). Необходимо, однако, знать, на какой хромосоме этот ген расположен.