Сведения о регуляторных механизмах экспрессии генов по большей части получены в результате излучения самого простейшего образца контроля активности генов, каким является контроль, распространяемый на последовательность реакции в биосинтезе, осуществляемом микроорганизмами. Известно два механизма, один из которых контролирует активность ферментов, тогда как второй — синтезирует ферменты (синтез специфических белков).
Сущность контроля (регуляции) активности ферментов иллюстрируется примером биосинтеза изолейцина, ранним предше-
ственником которого является треонин и превращение которого в изолейцин осуществляется в результате пяти последовательных реакций с участием ферментов. Если к культуре бактерий, обладающих самостоятельной способностью синтезировать аминокислоты, в том числе изолейцин, прибавить изолейцин, это приведет к прекращению клетками синтеза данной аминокислоты. Ростовые потребности клеток в это время обеспечиваются лишь экзогенным изолейцином. Механизм этого явления заключается в ингибирова- нии (подавлении) активности фермента, катализирующего превращение треонина в последующий предшественник изолейцина. Синтез восстанавливается лишь тогда, когда экзогенный изолейцин истощается в среде.
Уникальность этого явления связана с тем, что ингибитор (конечный продукт) и нормальный субстрат имеют различную структуру и не конкурируют за один и тот же сайт связывания на ферменте. Можно сказать, что фермент несет два сайта связывания, один из которых специфичен для субстрата, другой — для ингибитора. Нормально субстрат прикрепляется к активному сайту фермента. Однако если к этому специфическому сайту прикрепляется ингибитор, то наступает структурное превращение (транзиция) в ферменте, вследствие чего нормальный субстрат больше не прикрепляется, что блокирует активность фермента, катализирующего конец биосинтеза, либо одну из его стадий. Это явление получило название аллостерической транзиции (рис. 61).
В основе аллостерического взаимодействия лежит любое изменение в активности фермента, вызываемое избирательным связыванием на втором сайте фермента, причем этот сайт не перекрывает сайта на ферменте для связывания субстрата. Фермент, по существу, становится химическим трансдуктором, позволяющим взаимодействие между двумя молекулами — ингибитором и субстратом, которое другим способом исключено. Определенные ферменты чувствительны к активированию при соединении их с эффекторной молекулой, отличной от каталитического субстрата. Кроме того, определенные ферменты чувствительны к активированию одним метаболитом и подавлению другим. Поскольку возможны мутации, которые могут поражать один ингибиторный сайт, не затрагивая другого, фенотипически они проявляются в резистентности клеток к ингибированию конечным продуктом и в выработке ими больших количеств конечного продукта. Таким образом, аллостерическая транзиция
обеспечивает исключительно гибкую систему регуляции активности ферментов.
Рис. 61. Аллостерический переход: а — активный фермент:
1 — активный центр фермента, к которому присоединяется субстрат 3;
2 — активный центр фермента, к которому присоединяется ингибитор 4;
б — неактивный фермент: 1 — измененный активный центр
Синтез ферментов регулируется с помощью индукции и репрессии ферментов, заключающихся в стимуляции или подавлении синтеза специфических ферментов как ответной реакции на добавление в среду компонента, повышающего концентрацию эффектора в клетке.
Примером индукции ферментов является случай с ферментами бактерий, обеспечивающих утилизацию лактозы. Бактерии приобретают способность сбраживать лактозу после некоторого культивирования в присутствии этого углевода. Это определяется синтезом ими β-галактозидазы, которая расщепляет лактозу или другой β-галактозид, а также β-галактозидпермеазы и β -галактозидтрансацетилазы, обеспечивающих проникновение субстрата в клетку. Следовательно, лактоза индуцирует синтез ферментов, причем этот синтез является координированным.
Примером репрессии ферментов может служить синтез триптофана, который образуется из антраниловой кислоты с участием антранилатсинтетазы. Если бактерии посеять в среду, в которой в качестве источника азота и углерода содержатся NH4Cl и глюкоза соответственно, то они очень хорошо растут и самостоятельно синтезируют триптофан (как и другие аминокислоты). Но если в среду добавить экзогенный триптофан, то бактерии перестают синтезировать эту аминокислоту. Важно заметить, что добавление триптофана
останавливает синтез всех ферментов, участвующих в его биосинтезе. Таким образом, конечный продукт подавляет весь биосинтез.
Опираясь на данные об индукции и репрессии белков, французские ученые Ф. Жакоб и Ж. Моно (1961) сформулировали модель генетического контроля синтеза белков; ее компонентами являются гены структуры, регуляции и операторные гены, а также цитоплазматический репрессор. По этой модели молекулярная структура белков определяется генами структуры, первичный продукт которых — мРНК. Синтез мРНК может быть начат лишь на определенном пункте цепи ДНК (оператора), от которого может зависеть и транскрипция нескольких сцепленных структурных генов. Группа генов, транскрипционная активность которых координируется одиночным оператором, представляет собой оперон, являющийся единицей первичной транскрипции и единицей координированной экспрессии генов. Существуют также гены-регуляторы. Под контролем того или иного гена-регулятора продуцируется цитоплазматический фактор-репрессор, который обладает реверсивной способностью связываться со специфическим оператором. Благодаря этому связыванию комбинация репрессора и оператора блокирует начало транскрипции всего оперона (формирование мРНК), контролируемой оператором, и, следовательно, предотвращает синтез белков, управляемый струк- турными генами, принадлежащими оперону.
Репрессор обладает свойством специфически связываться (реагировать) с малыми молекулами (эффекторами). В случае индуцибельных ферментных систем репрессор связывается с оператором и блокирует транскрипцию оперона. Присутствие эффектора (индуктора) связывает (инактивирует) репрессор, и это приводит к тому, что происходит транскрипция и трансляция генов оперона. Другими словами, репрессор, соединенный с эффектором, теряет родство к оператору и не связывается с ним, а это сопровождается активацией оперона. В случае репрессибельных ферментов репрессор сам по себе неактивен, т. е. не имеет родства к оператору и не блокирует транскрипцию оперона. Он активируется лишь в результате комбинации (соединения) с конечным продуктом в биосинтезе, в результате чего блокирует транскрипцию оперона. Следовательно, транскрипция оперона происходит в отсутствие эффектора (конечного продукта), тогда как присутствие эффектора сопровождается ингибированием оперона.
Регуляторные механизмы в случае индуцибельных и репрессибельных систем имеют негативный характер, так как подавляют
синтез специфических белков. Регуляторный механизм оперирует на генетическом уровне, контролируя частоту синтеза мРНК.
Опероны классифицируют на катаболизирующие (индуцибельные) и синтезирующие (репрессибельные). Примером катаболизирующих оперонов является лактозный оперон (рис. 62), в состав которого входят структурные гены z, у и а, кодирующие (β-галактозидазу, (β-пермеазу и (β-трансацетилазу соответственно ген-регулятор /, кодирующий синтез репрессора (белок м.м. 37 200, состоящий из четырех идентичных единиц, содержащих по 347 аминокислотных остатков), прото- мотр, к которому присоединяется РНК-полимераза, и ген-оператор, управляющий функционированием структурных генов. Механизм регуляции лактозного оперона заключается в том, что в отсутствие индуктора (лактозы) репрессор активен, т. е. связан с оператором, и это блокирует транскрипцию полигенной мРНК. При наличии в среде индуктора репрессор теряет активность, т. е. связывается
Рис. 62. Лактозный оперон и его регуляция
с индуктором, в результате чего оператор становится свободным (деблокируется) и происходит транскрипция мРНК. Следовательно, лактозный оперон контролируется негативно путем контроля часто- ты синтеза мРНК.
Однако возможна и позитивная регуляция лактозного оперона. Если вслед за индуктором в среду, где выращены бактерии, прибавить глюкозу, то наступает катаболитная репрессия β-галактозидазы, сопровождающаяся снижением уровня циклического АМФ. Если же в культуру прибавить экзогенный цАМФ, то катаболитная репрессия снимается и лактозный оперон будет функционировать нормально. Таким образом, цАМФ — это позитивный регулятор (регуляция происходит в присутствии индуктора).
Примером биосинтезирующего оперона является триптофановый оперон (рис. 63), экспрессия которого находится под негативным контролем репрессора — продукта гена trp R. Репрессия конечным про- дуктом заключается в том, что неактивный в свободном состоянии репрессор не мешает транскрипции мРНК. Репрессор становится активным в результате связывания с конечным продуктом. Когда комплекс репрессор + конечный продукт связывает оператор, то это сопровождается подавлением синтеза мРНК.
Генетический контроль синтеза белков у прокариотов происходит на уровне как транскрипции, так и трансляции и затрагивает процессы начиная с синтеза мРНК и заканчивая элонгацией полипеп- тидных цепей (рис. 64).
Рис. 63. Триптофановый оперон
Рис. 64. Катаболизм арабинозы
В геноме эукариотических клеток содержится очень много геноврегуляторов. Регулирующие белки, синтезируемые под контролем этих генов, связываются со специфической последовательностью ДНК вблизи регулируемых генов.
Для некоторых организмов — эукариотов (например, микроскопических грибов) — также характерна опероновая организация функционально связанных генов, однако в случае большинства эукариотов считают, что либо у них оперонов нет, т. е. эукариотические гены регулируются индивидуально, транскрибируясь в моноцистронные мРНК, либо эукариотические гены регулируются частично полицистронно, частично моноцистронно. В пользу второго предположения свидетельствуют данные об обнаружении у нематоды С. elegans генов, организованных в оперонах. У организмов этого вида процессинг полицистрон- ной мРНК в моноцистронную мРНК происходит до трансляции.
Считают, что генетический контроль синтеза белков у высших эукариотов осуществляется, как на уровне транскрипции (частота синтеза мРНК, процессинг мРНК, транспорт мРНК из ядра, стабильность мРНК), так и на уровне трансляции (частота трансляции,
регуляция синтеза белковых факторов, ответственных за инициацию, элонгацию и терминацию полипептидной цепи). Полагают также, что в генетической регуляции имеет значение структура хро- матина, которая блокирует доступ специфических активирующих белков (активаторов) к промоторам. Установлен в клетках эукариотов специфический комплекс, который обеспечивает АТФ-зависимое разрушение нуклеосом, позволяя при этом активаторам связываться с нуклеосомным стержнем, что ведет к транскрипции.