НАСЛЕДСТВЕННОЙ ПАТОЛОГИИ

Второй этап диагностики наследственной патологии связан с использованием параклинических методов. При их применении врач обязан соблюдать ряд профессиональных требований и правил:

•  принимать самостоятельное решение (начинающий врач должен следовать решению врачебного консилиума) о назначении обследования больного пробанда с использованием параклинических методов;

•  принимать личное участие в проведении назначенных им параклинических методов, чтобы быть полностью уверенным в объективности полученных результатов;

•  всегда помнить, что «последнее слово» в постановке окончательного диагноза наследственного и врожденного заболевания принадлежит исключительно ему (юридическая обязанность врача), тогда как роль специалиста по параклинической диагностике (во многих случаях не врача, а биолога, физиолога или другого профессионала) в решении этого вопроса может быть только вспомогательной.

Кроме того, при переходе от лабораторной диагностики к постановке окончательного диагноза в случаях моногенного заболевания или хромосомного синдрома врачу необходимо соблюдать еще три дополнительных правила (всего их 6):

•  данные объективного врачебного осмотра должны совпадать с данными лабораторной диагностики;

•  должна исключаться возможность лабораторной ошибки, для избежания которой врач назначает (при малейшем подозрении на нее) проведение повторного лабораторного исследования образца биологического материала, взятого от одного и того же больного;

•  в случае планирования последующего деторождения здорового ребенка в семье консультируемого лица, в которой уже диагностировано моногенное заболевание, врач обязан подтвердить или отвергнуть факт гетерозиготного носительства будущими родителями генов данного заболевания (особенно тяжелых НБО) и только на этой основе делать заключение о прогнозе здоровья потомства.

Характеристика параклинических методов

К основным параклиническим методам относятся: методы аналитической биохимии (включая аналитические системы и программные продукты), иммунологические методы, цитогенетический метод, а также молекулярно-генетические методы обследования пробанда, его больных и здоровых родственников.

Большинство параклинических методов пришли в клиническую генетику из общей генетики, молекулярной биологии, биохимии, иммунологии и других сопряженных с ней областей молекулярной биологии и медицины. Показания для применения параклинических методов различаются в зависимости от поставленных целей и задач, одни методы применяются чаще, другие — реже.

Методы аналитической биохимии

Объектами лабораторного тестирования больного с наследственной патологией с помощью методов аналитической биохимии являются разные классы органических и неорганических соединений: аминокислоты, углеводы, липиды и их метаболиты, ионы металлов, сульфаты и др. При этом изучаются не только состав, но и концентрация структурных компонентов клеток и тканей, а также изменения активности ферментов, участвующих в их преобразованиях.

С помощью методов аналитической биохимии можно исследовать любую биологическую ткань и жидкость организма. Универсальность

этих методов широко используется в определении причин и механизмов наследственных заболеваний, выявлении гетерозиготного носительства патологических генов, а также антигенной несовместимости организмов матери и плода. Во многих случаях применяются комбинации биохимических методов с другими методами, например иммуногенетическое тестирование при анализе иммунодефицитных состояний и антигенной несовместимости матери и плода по группам крови и резус-фактору.

Другим примером служит иммуногистохимическое тестирование мышечных белков с помощью специфических антител при прогрессирующих мышечных дистрофиях Дюшенна и Беккера.

Методы аналитической биохимии бывают следующие.

•  Качественные. С их помощью определяют избыточную концентрацию субстратов заблокированных ферментных реакций или их производных, накапливающихся при НБО.

•  Количественные и полуколичественные. С их помощью определяют изменения концентрации веществ и нарушения кислотнощелочного равновесия.

Кроме того, разные количественные и полуколичественные методы аналитической биохимии широко применяются для эффективной диагностики НБО. Именно с этой целью была разработана и внедрена в практику здравоохранения развитых стран мира стандартная двухэтапная система обследования больных на основе программ массового (тотального) и селективного (выборочного) скрининга.

Первый этап — это экспресс-диагностика НБО у всех новорожденных (собственно массовый скрининг) или экспресс-диагностика в группах детей высокого риска конкретной наследственной патологии (селективный скрининг). Массовый скрининг охватывает популяцию целиком, а селективный — только часть популяции.

Выявляемые в ходе экспресс-диагностики наследственные заболевания, как правило, характеризуются широкой распространенностью, тяжелым прогредиентным течением, приводящим к инвалидности при отсутствии лечения, а также наличием высокочувствительных и эффективных методов их диагностики и лечения.

В ходе массового скрининга выполняются достаточно простые, надежные и экономически выгодные (как для лечебнопрофилактического учреждения, так и для самого пациента) ориентировочные экспресс-тесты с биологическими материалами, взятыми у новорожденных (кал, кровь, мокрота, моча, пот, слюна).

Селективный скрининг также основан на простых и надежных ориентировочных экспресс-тестах. Но в этом случае могут еще использоваться специальные методы диагностики наследственных заболеваний в группах пациентов высокого риска конкретной патологии. Например, у больных с врожденной катарактой проводится диагностика галактоземии, у больных с частыми обструктивными бронхитами — диагностика муковисцидоза.

В настоящее время разработан ряд экспресс-тестов и диагностических методов.

 А. Качественные тесты с мочой:

— органолептический тест на специфический цвет и запах при алкаптонурии, 3-гидроксил-3-метилглутаровой ацидурии, изовалериановой ацидемии, лейцинозе, тирозинемии, ФКУ, цистинурии;

— тест Бенидикта при алкаптонурии, галактоземии, врожденной непереносимости фруктозы, лактазной недостаточности, приеме антибиотиков;

— тест с хлоридом железа при алкаптонурии, гиперглицинемии, гистидинемии, лейцинозе, тирозинемии, ФКУ; этот тест также является положительным при гипербилирубинемии, лактатацидозе, кетоацидозе, меланоме, плеохромоцитоме и циррозе печени;

— тест с динитрофенилгидразином (ДНФГ-тест) при алкаптонурии, гиперглицинемии, гликогенозах, лактат-ацидозе, лейцинозе, ФКУ;

— тест с п-нитроанилином при метилмалоновой ацидурии;

— сульфитный тест при недостаточности молибденового кофактора;

— тест на гомогентизиновую кислоту при алкаптонурии;

— тест с нитрозонафтолом при галактоземии, тирозинемии, фруктоземии.

 Б. Полуколичественные тесты с мочой:

— тест на пролин при аминоглицинурии, пролинемии I и II;

— тест с цианид-нитропруссидом при гомоцистинурии, цистинурии;

— ЦПХ-тест при мукополисахаридозах.

Второй этап — это уточняющая диагностика. В ходе такой диагностики применяются более сложные количественные методы аналитической биохимии, а также молекулярно-генетические и молекулярноцитогенетические методы.

К количественным и качественным методам аналитической биохимии относятся: методы исследования метаболического пути, определение количества метаболитов, их кинетики и накопления.

Эти методы позволяют определить спектр разных классов органических и неорганических соединений (например, аминокислот) или концентрацию конкретного вещества (например, ФА или тирозина с помощью флуорометрии).

Среди количественных и качественных методов выделяются:

•  хроматомасс-спектрометрия (ХМС) или комбинированный метод хроматографии и масс-спектрометрии, с помощью которых анализируется количество и качество (включая молекулярную массу) желчных кислот, органических кислот (при аминоацидопатиях), холестерина и его производных (при болезнях холестеринового обмена);

•  электрофорез гликозоаминогликанов (ГАГ) — анализируются сложные сахара при мукополисахаридозах;

•  одномерная и двухмерная тонкослойная хроматография (ТСХ) — определяются спектр, количество и дефекты аминокислот, имидазолов, моно- и дисахаридов (при наследственных болезнях желудочно-кишечного тракта), олигосахаридов, мукополисахаридов, пуринов и пиримидинов, сиаловых и фенольных кислот — всего до 3000 соединений, являющихся метаболическими маркерами различных классов НБО;

•  высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) — определяются аминокислоты, птеридины (при «злокачественной» ФКУ), лактат, пируват, 3-гидроксибутират и ацетоацетат (при МТБ), ионы металлов и сульфаты (при болезнях обмена металлов), карнитин и его эфиры, хлориды, стероидные и тиреоидные гормоны, пурины и пиримидины;

•  газовая хроматография (ГХ) — анализируются холестерин и его производные, триацилглицериды, пипеколиновая и фитановая кислоты, жирные кислоты и плазмалогены (при пероксисомных болезнях);

•  тандемная масс-спектрометрия (ТМС) — анализируются аминокислоты и ацилкарнитины, разветвленные и неразветвленные дикарбоновые кислоты (от С6 до С14).

Биологическими материалами при этих методах служат плазма или сыворотка крови (количественные тесты), а также образцы мочи (качественные тесты).

Среди более сложных методов биохимического анализа значатся: методы прямого измерения концентрации (иммунохимические методы) и определения активности ферментов (энзимодиагностика), методы оценки физико-химических и кинетических параметров мутантных белков; методы исследования мутантных белков с помощью нагрузочных проб мечеными субстратами и методы гибридизации соматических клеток.

Существуют также методы исследования структуры мутантного гена с помощью рестрикционного анализа.

Аналитические системы и программные продукты

Говоря о значении методов аналитической биохимии для протеомики , следует отметить, что в настоящее время в России основная часть протеомных исследований выполняется с использованием стандартного метода двухмерного гель-электрофореза на полиакриламидном геле или метода 2-D PAGE. Вместе с тем, наиболее ощутимый прорыв в протеомике может быть обеспечен широким применением комбинаций методов ВЭЖХ и ТМС.

В пользу такого прогноза свидетельствуют результаты анализа образцов протеинов человека с помощью программного пакета TurboSEQUEST ТМ для автоматической идентификации протеинов. Этот пакет обеспечивает быструю и точную идентификацию даже при низких концентрациях белков в сложных смесях. Например, при применении жидкостного хроматографа «Surveyor» и массспектрометрического детектора «LCQ DECA XP» с анализатором — ионной ловушкой в течение всего 5 ч можно идентифицировать 95 протеинов, тогда как при применении стандартного метода 2-D PAGE — только 25 протеинов при более значительных затратах времени.

К современным протеомным аналитическим системам также относятся следующие.

•  ВЭЖХ Surveyor LC, которую характеризуют: короткий цикл анализа образцов, высокая производительность, позволяющие при малых скоростях потоков создавать условия для исследования огромного количества образцов. Система включает модуль подготовки растворителей — Solvent Platform, насос Surveyor MS Pump со встроенным дегазатором, автодозатор Surveyor Autosampler и детектор — фотодиодную матрицу Surveyor PDA.

•  Система Finnigan LCQ ADVANTAGE обеспечивает быструю идентификацию компонентов анализируемых образцов. Это компакт-

• ный настольный масс-спектрометр с анализатором — ионной ловушкой, способный выполнять исследования с подтверждением молекулярной массы, а также структурные анализы методом ВЭЖХ МС/МС. Селективность МС/МС обеспечивает идентификацию соединений путем их сравнения со спектральной библиотекой, что дает возможность получать количественные результаты для сложных матриц. Усовершенствованная система Finnigan LCQ DECA XP или идеальный масс-спектрометр (самый высокочувствительный прибор среди всех систем ВЭЖХ) для изучения метаболизма, анализа чистоты биологических образцов, идентификации протеинов и других сложных молекул, позволяющий полностью исследовать их структуру.

Таким образом, хроматография, масс-спектрометрия, аналитические системы и программные продукты относятся к основным инструментам современных исследований в протеомике.

Цитогенетические методы

Как сказано в главе 1, развитие цитогенетики начиналось с применения методов анафазного и телофазного анализа хромосом, затем появился более совершенный метод метафазного анализа хромосом, а в начале 80-х годов большое распространение получил самый информативный метод — анализ прометафазных хромосом.

Прометафазный метод подтвердил существование микрохромосомных мутаций: микроделеций, микродупликаций, парацентрических инверсий, лежащих в основе ряда наследственных болезней.

Такие микроперестройки хромосом нередко сопровождают рак. Например, свыше 500 нозологий МБ проявляются неоплазией, и среди них каждое второе заболевание сопровождается микроперестройками хромосом.

В клинической генетике с помощью цитогенетических методов проводится обследование пробанда, его больных и здоровых родственников или обследование плода при подозрении на хромосомное нарушение.

Таким образом, цитогенетические методы диагностики применяются для кариотипирования и цитогенетического анализа хромосомного набора пробанда, его больных и здоровых родственников (см. главу 2).

Иммунологические методы

В середине XX в. были разработаны применяемые при подозрении на наследственные иммунодефицитные состояния (атаксиятелеангиэктазия, дис- и агаммаглобулинемия и др.) иммунологические методы. С их помощью исследуют антигенную несовместимость матери и плода, устанавливают биологическое отцовство, изучают генетические маркеры при анализе сцепления генов и оценке наследственной предрасположенности к болезням (гены с выраженным фенотипическим проявлением). В числе таких методов значатся: анализ гамма-глобулинов, В- и Т- лимфоцитов, содержания комплемента в крови, исследование функции фагоцитарных клеток, определение HLA-антигенов в лейкоцитах и др.

Молекулярно-генетическая диагностика: подходы и характеристика

Целью молекулярно-генетических методов диагностики наследственной патологии является определение нарушений молекулярной структуры и функционирования генов, их белковых и небелковых продуктов. Эти методы относятся к основным диагностическим тестам, применяемым в клинической генетике последних лет.

Необходимость разработки этих тестов была обусловлена молекулярной природой наследственной патологии, ее выраженным генетическим и клиническим полиморфизмом, наличием аллельных серий, генокопий и фенокопий и другими особенностями, создающими для врача трудности в дифференциальной диагностике заболеваний (см. главы 2-5 и 17).

Широкое распространение получила ДНК-зондовая диагностика, или ДНК-диагностика.

Известно, что молекула ДНК, являясь главной молекулой жизни, сохраняет свою стабильность в течение всего онтогенеза (см. главы 2 и 12). Эта молекула одинакова во всех клетках, что делает ее абсолютно пригодной для диагностики наследственной патологии.

Задача ДНК-диагностики.

• Исследование мутаций патологического гена — это прямой подход. Используется в случаях, когда известны ген заболевания и его основные мутации, например, для диагностики муковисцидоза (мажорная мутация — del F508), ФКУ (R408W), хореи Гентингтона (экспансия CTG-повторов). Кроме того, прямой подход применяется для выявления в популяции гетерозиготного носительства

• генов рецессивно наследуемых заболеваний у родителей и родственников больного пробанда. Анализ сегрегации (накопления) заболевания в семейной родословной, характеризующейся наличием измененных аллелей полиморфных (маркерных) локусов, тесно сцепленных с патологическим геном (однонуклеотидные замены, делеции, инсерции оснований, нуклеотидные повторы) — это косвенный подход. Такой подход применяется в тех случаях, когда прямой подход не дает результата (например, при большой протяженности и сложной организации гена, а также при широком спектре его мутаций) или когда не выделен патологический ген, а известна только его локализация на хромосоме. Объектом исследования при косвенной ДНК-диагностике являются полиморфные сайты — микросателлитные повторы (мономеры) протяженностью до 5 н.п. и минисателлитные повторы (мономеры), содержащие 5-60 н.п. И микро-, и минисателлитные повторы разбросаны по всему геному и наследуются по моногенному варианту.

Вместе с тем, наиболее типичными считаются микросателлитные сайты (динуклеотидные повторы), в том числе самый распространенный СА-повтор (цитозин-аденин).

Оба подхода (прямой и косвенный) базируются на идентификации небольших и строго определенных фрагментов молекулы ДНК с последующим анализом при помощи электрофореза в агарозном (или полиакриламидном) геле либо с помощью радиоавтографии.

Следует отметить, что золотым стандартом ДНК-диагностики наследственной патологии (особенно МБ) является комплексное применение и прямого, и косвенного методов, что позволяет врачу получить наиболее адекватный результат.

Базовые методы ДНК-диагностики

В основе многочисленных методов ДНК-диагностики лежат два базовых метода: блот-гибридизационный анализ и ПЦР.

Блот-гибридизационный анализ

Блот-гибридизационный анализ — это самый первый метод исследования молекулы ДНК, предложенный Э. Саузерном еще в 1975 г. Именно этот метод стал универсальной технологической основой для идентификации мутаций в патологических генах.

Сущность метода заключается в следующем: ДНК, выделенная из биоптата органа, ткани или культуры лимфоцитов периферической

крови, подвергается расщеплению рестриктазами*, которые «узнают» в ней строго определенную последовательность нуклеотидов. Несмотря на нарезание рестриктазами множества фрагментов ДНК разной длины, их набор для каждого индивида всегда постоянен по количеству и величине данной рестриктазы.

Далее из множества нарезанных фрагментов нужно найти один или несколько фрагментов ДНК с определенной последовательностью и охарактеризовать их. С этой целью полученную смесь фрагментов подвергают электрофорезу, в ходе которого фрагменты ДНК разделяются по размеру (мелкие в геле мигрируют быстрее больших). Затем разделенные фрагменты «перепечатывают» на целлюлозный фильтр или нейлоновую мембрану, фиксируют и подвергают гибридизации с зондом (олигонуклеотидом), интенсивно меченным радиоактивным изотопом или флуоресцентной меткой.

Такой зонд является ключевым элементом — это искусственно клонированная с помощью генно-инженерных методов нуклеотидная последовательность конкретного гена. Именно зонд выявляет необходимый фрагмент, присутствующий среди исследуемого множества фрагментов. При этом происходит специфическое связывание последовательностей зонда с комплементарными ему последовательностями фрагмента ДНК, зафиксированного на фильтре.

Далее следует отмывка несвязанной с фильтром радиоактивной метки и экспозиция фрагмента на рентгеновской пленке. Изменение положения фрагмента по сравнению с контролем, его исчезновение или появление нового фрагмента свидетельствуют о перестройках последовательностей нуклеотидов в исследуемом гене или его ближайшем окружении.

В настоящее время блот-гибридизационный анализ ограниченно применяется для гибридизации ДНК-зондов с электрофоретически разделенными молекулами РНК (нозерн-блот) или молекулами белков, фиксированных на фильтре с мечеными антителами (вестерн-блот).

Полимеразная цепная реакция

ПЦР — второй по значимости метод ДНК-диагностики, метод специфической амплификации (копирования или умножения), зна-

* Рестриктазы — это своеобразные «биологические ножницы». В настоящее время получены рестриктазы, «узнающие» более 500 специфических последовательностей нуклеотидов с длиной от 4 до 8 пар и более.

чительно потеснивший блот-гибридизационный анализ. Метод ПЦР был предложен в 1983 г. К. Муллисом, удостоенным за его разработку Нобелевской премии в 1992 г.

Метод ПЦР позволяет в течение одного часа увеличить in vitro в миллионы раз количество заданного фрагмента геномной ДНК (имеющего длину от нескольких десятков до нескольких тысяч н.п.), что существенно облегчает поиск искомой мутации или изучение полиморфных сайтов.

Необходимым условием для проведения ПЦР служит знание нуклеотидных последовательностей ДНК, фланкирующих участок амплификации (находятся на его флангах). Такие участки называются «затравками» или олигопраймерами. Их длина — 20-30 пар оснований, они комплементарны З’-концам амплифицируемых участков на смысловой и антисмысловой нитях ДНК.

На основе свойства комплементации определяют длину амплифицируемых участков, соответствующую расстоянию между олигопраймерами.

Принципиальная схема ПЦР приведена на рис. 61. ПЦР идет в четыре этапа на специальных программных термоциклерах, задающих и поддерживающих определенный температурный режим реакции. Компонентами этой реакции служат: матричная ДНК, олигопраймеры, смесь дезоксинуклеотидов и термофильная ДНК-полимераза. Их добавляют в специальный солевой буфер непосредственно перед помещением пробирки в термоциклер. На первом этапе реакции двухнитевая матричная ДНК переводится в однонитевую форму при нагревании в течение нескольких минут до температуры 95-98 °С. На втором этапе (этап гибридизации) температура реакционной смеси снижается до 30-50 °С, и олигопраймеры гибридизируются с денатурированной (одноцепочечной) ДНК, содержащей комплементарные участки. На третьем этапе температура повышается до 60-70 °С (она оптимальна для термофильной ДНК-полимеразы), что позволяет запустить синтез ДНК в направлении от 5′- к 3′-концу геномной ДНК-матрицы. На четвертом этапе происходит дальнейшее повышение температуры до 80-90 °С, что прекращает синтез ДНК, и начинается денатурация с освобождением синтезированных фрагментов ДНК с геномной матрицы.

В результате образовавшиеся фрагменты ДНК становятся матрицами для следующих циклов амплификации, и процесс может протекать в геометрической прогрессии, давая необходимое количество циклов. Если один полный цикл амплификации занимает 1-2 мин,

Рис. 61. Принципиальная схема ПЦР (по Баранову В.С., Иващенко Т.Э., 2005)

то в течение 25-30 циклов количество синтезированных копий ДНК достигнет несколько миллионов. При этом выбор оптимального режима работы определяется длиной и специфичностью амплифицируемого участка молекулы ДНК.

Анализ результатов ПЦР проводится с помощью гельэлектрофореза продуктов амплификации, которые в случае необходимости обрабатываются рестриктазами. В дальнейшем гели окрашивают бромидом этидия и исследуют продукты рестрикции в проходящем УФ-свете с длиной волны 380 нм на наличие в них невыявленных мутаций. Таким образом, ПЦР служит универсальной моделью для получения образцов фрагментов ДНК, обусловливающих развитие наследственной патологии.

В настоящее время на основе ПЦР разработано множество диагностических тестов, позволяющих эффективно диагностировать самые разные формы наследственной патологии.

Оцените статью
yamedik
Добавить комментарий