В здоровом организме процесс апоптоза сбалансирован процессом физиологической регенерации клетки. Апоптоз — это генетически контролируемый молекулярный (биохимический) механизм, ответственный за поддержание постоянной численности нормальных клеток, выбраковку и удаление дефектных клеток и, следовательно, выживание, старение и смерть клеток и тканей организма. Как правило, апоптоз — это результат опосредованного (через рецепторные системы клетки) неспецифического или нефизиологического действия внешних факторов, выступающих как индукторы, способные при интенсивном воздействии вызвать гибель клетки. Вместе с тем, апоптоз связан с внеклеточными и внутриклеточными сигналами, выступающими в роли мощных физиологических факторов.
Прежде всего, к таким факторам относятся гормоны (например, половые гормоны), которые либо индуцируют, либо ингибируют гибель клетки в зависимости от стадии ее дифференцировки (см. главы 9 и 14).
Другими физиологическими факторами являются цитокины или продуцируемые клетками сигнальные (полифункциональные) пептиды, связывающие специфические рецепторы на клетках-мишенях. В зависимости от функции цитокины делятся на факторы роста, факторы семейства TNF, интерлейкины и интерфероны (см. главу 8). Действие цитокинов на клетки неоднозначно (так же как у гормонов): для одних клеток они являются индукторами, для других — ингибиторами апоптоза, что связано с типом клетки, стадией дифференцировки, функциональным состоянием. Следовательно, программированная гибель клетки зависит от соотношения специфических и неспецифических регуляторов (физиологических и нефизиологических).
Молекулярно-биохимические критерии апоптоза
К молекулярно-биохимическим критериям апоптоза относятся:
• энергозависимость; определяется самой клеткой благодаря наличию АТР (соотношение в клетке АТР/АДР);
• расщепление ядерной ДНК на фрагменты, кратные 180-200 н.п., что приводит к формированию на электрофореграмме ДНКовой лестницы;
• уменьшение объема клетки; клетка сморщивается в течение нескольких минут, теряя до 1/3 своего объема;
• активация цистеиновых протеаз (каспаз), вызывающих деградацию белков;
• экстернализация или появление ФС на наружной поверхности плазматической мембраны; связана с формированием из мембраны апоптотических телец (фрагментов), способствующих их узнаванию макрофагами и последующему фагоцитозу.
Фазы апоптоза
Выделены четыре фазы апоптоза: инициация апоптотического сигнала (первая), трансдукция или проведение апоптотического сигнала (вторая), активация каспаз (третья), деградация ДНК (четвертая).
Инициация, трансдукция и проведение апоптотического сигнала
В зависимости от характера стимула, инициирующего апоптоз, выделяют два сигнальных каскада (пути): рецепторный и митохондриальный.
Рецепторный путь опосредован специфическими «рецепторами смерти», расположенными на плазматической мембране — это факторы TNF .
Наиболее изучен рецептор Fas (Fas-R), или CD95. Его цитоплазматический домен обогащен цистеином, а интегральная (мембранная) часть содержит «домен смерти», или DD, вовлекаемый в белокбелковое взаимодействие с генерацией «сигнала смерти». Лиганд этого рецептора (Fas-L) относится к цитокинам — пептидам из семейства TNF; он экспрессируется на активированных Т-лимфоцитах и естественных киллерах. Связывание лиганда Fas-L с рецептором Fas-R приводит к олигомеризации последнего и формированию сигнального комплекса, инициирующего каскад реакций апоптоза.
В олигомеризации Fas-R участвуют: цитоплазматический DD-домен рецептора, адапторный пептид FADD (Fas- ассоциированный DD, содержащий DED-эффекторный «домен смерти») и прокаспазы-8. Образование этих белков активируют каспазы-8 (см. ниже), что вызывает каскад апоптотических реакций.
В последние годы установлено, что мутации в генах Fas и Fas-L обусловливают развитие ряда аутоиммунных заболеваний, а в случае появления опухолевых клеток активность каспазы-8 может ингибироваться специфическим белком FLIP, препятствующим апоптозу.
Также описан апоптоз, инициированный связыванием рецепторов семейства TNF, содержащих домены DD (TNF-R), с лигандом TRAIL. Их олигомеризация аналогична Fas-R / Fas-L и осуществляется с участием FADD и сходного с ним пептида TRADD (TNF- R-ассоциированный DD). Все указанные примеры характеризуют рецепторный путь апоптоза.
Активация каспаз
Каспазы — это специфические цистеиновые протеазы, катализирующие расщепление белков. Они считаются ключевыми ферментами апоптоза, расщепляющими пептидную связь по карбоксильному концу остатка аспарагиновой кислоты, что ведет к активации или инактивации белка. Мишенями для каспаз служат белки, деградация которых вызывает развитие характерных для апоптоза необратимых процессов — это мембранные белки, белки ядра и цитоплазмы клетки.
Выделено 14 типов каспаз, синтезируемых в виде зимогенов или прокаспаз (имеют большой молекулярный вес), которые затем активируются путем протеолитического процессинга.
В зависимости от функции семейство каспаз делится на 2 подсемейства.
• Первое подсемейство — это каспазы-1, -4 и -5, участвующие в созревании цитокинов. Сюда также относятся интерлейкин-1 бета и интерлейкин-18, усиливающие противовоспалительные свойства цитокинов.
• Второе подсемейство — это каспазы, участвующие в ферментативном каскаде реакций апоптоза. Среди них выделяют эффекторы (гидролизуют структурные белки) и индукторы (принимают и передают апоптотические сигналы).
В неповрежденной клетке активность каспаз регулируется путем:
• взаимодействия индуктора апоптоза со специфическими рецепторами, например, активация каспазы-8 в Fas/Fas-L системе;
• образования гетеродимеров каспаз со специфическими регуляторными белками семейства Вс1-2 (см. ниже);
• взаимодействия каспаз с сериновой протеазой или гранзимом В (GrB) при воздействии цитотоксических Т-лимфоцитов.
Высказаны предположения, что действие каспаз на белки цитоскелета клетки приводит к изменению ее формы и что ингибиторы каспаз не полностью блокируют сморщивание клетки.
В апоптозе может участвовать цитозольная фосфолипаза, которая служит субстратом для каспаз 2 и 8 (см. главы 6 и 10). Возможно, что инактивация цитозольной фосфолипазы ведет к снижению синтеза противовоспалительных простагландинов, образующихся из арахидоновой кислоты, которая является продуктом гидролиза фосфолипидов.
Для TNF-индуцированного апоптоза также показана активация каспазой-3 цитозольной фосфолипазы.
Участие фосфолипаз, вероятно, усиливает повреждение лизосом, что связано с наличием «лизосомо-митохондриальной оси» апоптоза, определяющей эффекты каспаз, лизосомных гидролаз и генерацию митохондриями АФК. На рис. 48 показаны некоторые пути передачи апоптозного сигнала в клетке, включая митохондриальный путь, при котором действие индукторов апоптоза ведет к резкому снижению величины электрохимического потенциала митохондрий и сопровождается выходом в цитоплазму цитохрома-с, который инициирует активацию каспаз.
Наряду с выходом в цитоплазму цитохрома-с возможно высвобождение митохондриями других медиаторов: прокаспаз-2, -3 и -9, AIF, эндонуклеазы G, что, по-видимому, контролируется белками
Рис. 48. Некоторые пути передачи апоптозного сигнала в клетке (по Скулачеву В.П., 2001)
семейства Вс 1-2 (см. выше), которые кодируются одноименными генами и относятся к наиболее известным внутриклеточным регуляторам апоптоза (для них характерны гомологичные домены или домены ВН 1-4).
В зависимости от функции среди этих регуляторов апоптоза выделяют: антиапоптотические белки (Вс1-2, Вс1-3, Вс1-х, Мс1-1) с доменами ВН 1, 2, 4 и проапоптотические белки (Bid, Bad, Bax, Bim) c доменом BH 3. Например, белок Bid (tBid) взаимодействует с митохондриальными липидами, индуцируя высвобождение эндонуклеазы G и внедрение лизофосфолипидов (особенно лизоФХ) в мембрану митохондрий с последующим ее разрывом. В этом случае эффект разрыва мембраны, вероятно, связан с «заякореванием» С-концевых доменов проапоптотических белков Вс1-2, что способствует их воздействию на мембраны эндоплазматического ретикулума и митохондрий с возможным формированием в них гигантских транзитных пор (РТР) или мегаканалов.
Считается, что соотношение белков этого семейства определяет предрасположенность или устойчивость клеток к апоптозу. Важной общей чертой для митохондриального и рецепторного путей апоптоза
является деполяризация (дезинтеграция) митохондрий, сопровождающаяся глубокими изменениями проницаемости их мембран с последующим образованием мегаканалов. Одним из них служит неспецифический канал, образующийся при окислении SH-группы Cys-56 в аденин-нуклеотидтранслоказе — это белок внутренней мембраны митохондрий, осуществляющий антипорт АТФ/ΑΌΦ (см. главу 6). Этот мегаканал (РТР-комплекс) содержит множество мишеней для внешнего воздействия и регулируется такими эндогенными факторами, как АФК и оксид азота, либо изменениями электрохимического потенциала митохондрий и концентрации ионов Са2+ и Mg2+, а также изменениями соотношений АТФ и ΑΌΦ, липидов и белков, белков Вс 1-2 и др.
Считается, что гигантская пора интегрирует ответные реакции клетки на стрессовое воздействие, и ее раскрытие происходит практически при всех процессах клеточной гибели, что изменяет проницаемость митохондрий.
Деградация ДНК
Если начальные стадии апоптоза различаются в зависимости от типа клеток и индуцирующих сигналов, то фаза деградации ДНК универсальна для большинства клеток. Это необратимая терминальная стадия апоптоза, контролируемая белками семейства Вс1-2.
К хорошо изученным ядерным белкам-регуляторам апоптоза относится белок р53 (мол. масса 53 кДа) или фактор транскрипции, запускающий апоптоз и блокирующий процесс деления клетки с поврежденной ДНК — это первая особенность апоптоза. Так, на ранних стадиях повреждения ДНК экспрессия фактора р53 повышается, что блокирует клеточный цикл в фазах G1 и G2 (см. главу 9) и предоставляет клетке возможность репарировать поврежденную ДНК фосфолипазой PLA2, предотвращая тем самым появление мутаций.
Если активность клеточных систем репарации недостаточная (см. главу 11) и повреждения в ДНК сохраняются, то в таких клетках индуцируется апоптоз.
Накопление в клетке фактора р53 возможно при обоих путях апоптоза.
Вместе с тем, почти у 50\% типов изученных опухолевых клеток ген р53 был инактивирован, и связанная с ним регуляция клеточного гомеостаза была нарушена, что приводило к накоплению дефектных клеток.
Вторая особенность апоптоза — это концентрация в цитоплазме свободного ионизированного кальция. Повышение его уровня способствует запуску апоптозного митохондриального каскада сигналов, инициирующего образование транзитных пор и выход в цитоплазму цитохрома-с и эндонуклеазы G.
В освобождении кальция из клеточных депо принимают участие вторичные мессенджеры: диглицерид и инозитол-1,4,5-трифосфат (IP3), генерация которых в клетке связана с активацией разных изоформ фосфолипазы С (см. выше).
С нарушением нормального гомеостаза кальция связана инициация апоптоза некоторыми токсинами. Однако для этого необходимо сохранение основного пула АТР, иначе клетка может перейти к другому механизму гибели — некрозу (см. ниже).
Роль фосфолипидов и других соединений в апоптозе
Завершение апоптоза — это фаза фрагментации погибшей клетки на «апоптотические тельца«. В этой фазе наиболее существенные процессы протекают в плазматической мембране, где происходит перераспределение фосфолипидов, а во внешнем монослое мембраны наблюдается экстернализация ФС, его присоединение к ней (транслокация) и последующее окисление (см. главу 6).
Транслокация ФС осуществляется с участием Са2+- активированной скрамблазы и КЛ митохондрий (в случае свободнорадикального окисления). Эта скрамблаза — сигнал к поглощению «рецептора внешнего ФС», который экспрессируется в разных клетках и тканях, и благодаря этому «апоптотические тельца» захватываются и перевариваются не только фагоцитами, но и соседними клетками. При этом рецепторы к ФС оказывают противовоспалительное действие, подавляя иммунную реакцию фагоцитирующей клетки. Кроме того, в апоптотической клетке возрастает генерация лизоФХ, который служит хемотаксическим фактором — источником сигнала «seak me», стимулирующего приток фагоцитов к данной области.
В апоптоз вовлечены в качестве сигнальных вторичных мессенджеров такие производные фосфолипидов, как церамиды, сфингозин и SIP, способные к регуляции как процессов выживания, так и гибели клетки.
Например, церамид регулирует ключевые факторы апоптоза: полярное перераспределение и олигомеризацию рецептора Fas с формированием суперкаталитического домена, дестабилизацию митохондриальных мембран (путем участия Вах-индуцированных неспецифических
церамидных пор и повышения проницаемости мембран), а также высвобождает апоптогенные факторы, например, цитохром-с. В свою очередь, сфингозин (производное церамида) усиливает апоптоз под действием церамидаз, ингибируя протеинкиназу С (см. главу 6).
Из церамида же образуется SIP или сигнальный липид, обладающий антиапоптотическими свойствами. Его эффекты реализуются с помощью четырех механизмов:
• активации антиапоптотических сигнальных путей (NFkB, ERK- киназа);
• снижения в лимфоцитах экспрессии проаптотических белков Вс1-2 (Вах), блокирующих апоптоз (см. выше);
• антиапоптотического действия по предотвращению процессов, индуцированных стрессом в митохондриях (блокирование выхода цитохрома-с и активации каспаз);
• блокирования апоптоза в эндотелиальных клетках путем повышения уровня оксида азота.
В последние годы была также продемонстрирована специфическая роль в апоптозе мембранных рафтов, что связано с регуляцией ионных каналов и сборкой сигнальных комплексов (см. главу 8). При этом индукторы апоптоза вызывали реорганизацию рафтов и их укрупнение в большие «мембранные платформы», обогащенные церамидами.
Завершая рассмотрение механизмов апоптоза, следует отметить, что повреждение клеточной мембраны не является его первопричиной, хотя и служит важной составляющей механизма апоптоза (здесь происходят олигомеризация и наружная ориентация апоптозных рецепторов и локализуются многие апоптотические сигналы, включая экстернализацию ФС).