КАК ОСНОВА ДИФФЕРЕНЦИРОВКИ
Зрелая яйцеклетка, которую Т.Х. Морган справедливо считал самой дифференцированной клеткой в организме, представляет собой мозаичную, высокогетерогенную систему. Один из процессов, приводящий к гетерогенности яйцеклетки — овоплазматическая сегрегация.
Неравномерное распределение компонентов цитоплазмы в яйцеклетке можно обнаружить уже на стадии созревания. Как было показано в п. 7.2, овоплазматическую сегрегацию сопровождает поляризация яйцеклетки. Остановимся более подробно на процессах, приводящих к овоплазматической сегрегации и роли последней в дифференцировке клеток развивающегося зародыша.
Формирование сегрегации цитоплазмы подробно изучено в созревающем яйце дрозофилы. Неоднородность цитоплазмы яйцеклетки возникает в том числе вследствие неравного положения ее полюсов среди клеток материнского организма. К переднему полюсу яйцеклетки примыкают фолликулярные и питающие клетки, которые продуцируют мРНК для белка bicoid. Эта мРНК транспортируется в яйцеклетку, и еще до оплодотворения устанавливается градиент ее концентрации с максимумом на переднем конце яйцеклетки, что обусловливает в дальнейшем развитии формирование головных структур зародыша из этой части яйца. Будущий задний полюс соседствует с фолликулярными клетками, которые доставляют в эту область яйца мРНК, считанную с гена nanos, детерминирующую образование заднего конца зародыша (рис. 8.26). Таким образом, еще в неоплодотворенной яйцеклетке дрозофилы формируется передне-задняя ось будущего организма. Аналогично задается и дорсо-вентральная ось. Вещества, имеющие четкий градиент распре-
Рис. 8.26. Распределение морфогенов по продольной оси яйца дрозофилы
деления, принято называть морфогенами. Следует обратить внимание, что градиенты морфогенов в яйцеклетке дрозофилы создаются благодаря активности в окружающих яйцо фолликулярных и питающих клетках генов материнского организма. Они получили название — «гены с материнским эффектом».
Следует обратить внимание, что большинство запасенных в яйцеклетке мРНК первоначально находится в неактивном состоянии в комплексе с белком в виде информосом. Такие неактивные мРНК могут быть распределены в цитоплазме достаточно равномерно. Создание их градиентов осуществляется благодаря их неравномерной активации. Механизмы активации могут быть различными. Так, например, установлено, что фиксация мРНК на цитоплазматическом матриксе яйцеклетки (локализация мРНК в определенных зонах яйца) приводит к их активации. Показано, что в дальнейшем транслируются только локализованные мРНК, а нелокализованные разрушаются.
Другие механизмы избирательной трансляции запасенных мРНК наблюдаются на следующих этапах формирования овоплазматической сегрегации и связаны с перемещениями цитоплазмы вследствие оплодотворения.
Проникновение сперматозоида в яйцеклетку в момент оплодотворения и последующее движение его пронуклеуса приводит к усилению овоплазматической сегрегации. В яйце наблюдаются сложные перемещения цитоплазмы и ее функциональная перестройка. В результате она становится еще более неоднородной. Этот процесс хорошо заметен в тех случаях, когда разные участки цитоплазмы содержат гранулы веществ разной окраски (желток, темный пигмент и др.).
Хорошим примером может служить яйцо асцидии. Серая цитоплазма центральной части яйцеклетки окружена кортикальным слоем, содержащим желтые липидные включения. На анимальном полюсе располагается светлая цитоплазма с ядерным материалом. Сразу после оплодотворения цитоплазма яйца перемещается, и кортикальный ее слой формирует желтый серп, расположенный между экватором и вегетативным полюсом (рис. 8.27).
Перемещения цитоплазмы вследствие оплодотворения хорошо заметны и в яйцеклетке амфибий. В ней слой темного пигмента меланина первоначально покрывает все анимальное полушарие. После проникновения сперматозоида поверхностный — кортикальный — слой цитоплазмы толщиной в несколько микрометров поворачивается примерно на 30о относительно внутренней массы желтка в направлении, которое
Рис. 8.27. Сегрегация цитоплазмы в яйце асцидии Styelapartita: а — до оплодотворения; б — после оплодотворения; 1 — кортикальная цитоплазма с желтыми липидными включениями; 2 — цитоплазма, содержащая желток; 3 — светлая цитоплазма с ядром ооцита; 4 — желтый серп; 5 — цитоплазма с желтком; 6 — серый серп; 7 — анимальная светлая цитоплазма; 8 — хорион
зависит от места проникновения сперматозоида. В результате этого у некоторых амфибий против места проникновения спермия появляется серповидная слабопигментированная область, названная серым серпом. В ней позже, в ходе гаструляции, возникает дорзальная губа бластопора. Вследствие всех указанных перемещений цитоплазмы формируются оси зародыша. Сторона, где формируется серый серп, становится дорзаль-ной, а противоположная, где наблюдается внедрение сперматозоида — вентральной. Анимально-вегетативная ось соответствует головно-хво-стовой оси будущего зародыша (см. рис. 7.3).
Перемещения цитоплазмы вследствие проникновения спермия в яйцеклетку — еще один механизм, приводящий к избирательной трансляции запасенных в яйцеклетке мРНК. В частности, благодаря в том числе и этому механизму осуществляется детерминирование дорсо-вентральной оси зародыша. В оогенезе у амфибий на вегетативном полюсе яйца запасаются мРНК для белка Xwnt11. После оплодотворения и поворота цитоплазмы часть этой мРНК перемещается по стороне, противоположной внедрению сперматозоида, в направлении анималь-ного полюса. В области серого серпа происходит полиаденилирование молекул мРНК Xwnt11, что приводит к их активации и последующей трансляции. В результате только в этой области яйца образуется соответствующий белок — один из основных дорсализующих факторов. Остальная мРНК для Xwnt11 в вегетативном полушарии, по-видимому,
остается репрессированной. Выполненные исследования установили, что именно поворот цитоплазмы является механизмом, запускающим трансляцию мРНК Xwnt11 через полиаденилирование.
Анализ результатов многих проведенных экспериментов позволил сделать вывод, что в создании сегрегации цитоплазмы яйцеклетки ведущая роль принадлежит цитоскелету. Так, транспорт мРНК, поступающих из окружающих клеток и синтезированных в самой яйцеклетке, к месту их локализации в цитоплазме осуществляется на большие расстояния по микротрубочкам, а на малые — по микрофиламентам. Считают, что местом локализации в клетке морфогенетических детерминант может быть кортикальный слой или цитоскелет клетки. Предполагают также, что и перемещения цитоплазмы яйца, наблюдаемые после оплодотворения, определяются цитоскелетом. В частности, в этом процессе возможно значительное участие центриоли сперматозоида и отходящих от нее микротрубочек. С помощью нарушающего сборку микротрубочек колхицина удается подавить транспорт и активацию мРНК, перемещения цитоплазмы и ооплазматическую сегрегацию в целом.
В ходе дробления разные участки цитоплазмы зиготы, содержащие специфический набор веществ, попадают в разные бластомеры. Экспериментами с микроинъекциями коллоидных частиц золота показано, что при дроблении цитоплазма яйцеклетки распределяется между бла-стомерами, не перемешиваясь. Различия в характере цитоплазмы могут служить регулятором считывания информации с разных генов в разных бластомерах и тем самым влиять на ход их дифференцировки. Показано, что цитоплазматические факторы белковой природы проникают в ядро бластомера и путем избирательной активации или инактивации конкретных генов определяют характер считываемой информации. Полагают, что таким способом морфогенетические детерминанты, содержащиеся в отдельных участках цитоплазмы, жестко, порой необратимо контролируют предопределенность (детерминированность) данного бластомера к образованию клеток определенного типа.
Такое жесткое предопределение судьбы бластомеров наблюдается у оболочечников, к которым относятся и асцидии. Неоднократно экспериментально доказано, что у этих животных каждый бластомер ответственен за образование специфического набора тканей личинки, при этом каждая клетка дифференцируется автономно, независимо от окружающих ее клеток. Тунг и другие исследователи пересаживали в цитоплазму бластомера, лишенного генетического материала, ядро из другого бла-стомера. Показано, что дальнейшее развитие клетки-реципиента идет
по пути того бластомера, чья цитоплазма ему досталась. Обнаружено также, что удаление у оболочечников каких-либо бластомеров приводит к отсутствию у личинки как раз тех структур, которые в норме из них формируются, а изоляция определенных групп клеток зародыша приводит к формированию из них характерных структур вне связи с другими клетками. Так, в серии экспериментов на 8-клеточном зародыше оболо-чечников показана способность только одной пары бластомеров, содержащих фермент ацетилхолинэстеразу, давать начало мышечной ткани.
У асцидий после оплодотворения по-разному окрашенные области цитоплазмы яйца распределяются по разным бластомерам, детерминируя их дальнейшую судьбу. Клетки бластулы, унаследовавшие цитоплазму желтого серпа, дают начало мышечным клеткам, цитоплазму серого экваториального серпа — образуют хорду и нервную трубку, анимальную цитоплазму — становятся эпидермисом личинки, содержащие желток вегетативной области — формируют в ходе развития кишку (см. рис. 8.27).
Жесткая детерминация судьбы бластомеров, определяемая составом веществ попавшего туда участка цитоплазмы яйца, обнаружена и у ряда других животных, например гребневиков, круглых и кольчатых червей, моллюсков. Тип развития этих животных, дифференцировка клеток которых определяется очень рано в развитии благодаря прежде всего ово-плазматической сегрегации, назван мозаичным.
Помимо овоплазматической сегрегации в определении судьбы бла-стомеров на самых ранних этапах развития может принимать участие и другой системный механизм — межклеточные взаимодействия. В этом случае развитие бластомеров в большей степени зависит от их взаимодействий с соседними клетками, межклеточным матриксом, которые определяются положением этих бластомеров в зародыше. Подобный тип развития, наблюдаемый у иглокожих и позвоночных, назван регуляционным.
Следует, однако, иметь в виду, что в развитии и мозаичных, и регуляционных зародышей участвуют оба механизма, однако степень их влияния значительно разнится, и основную роль играет один из них. Так, локализация специфических белков или м-РНК в определенных областях зиготы не ограничена мозаичными зародышами. Обнаружено, что анимальные и вегетативные области яиц амфибий, имеющих регуляционный тип развития, содержат уникальные мРНК. Кроме того, в цитоплазме вентральной области зиготы лягушки была выявлена так называемая половая детерминанта. Клетки, получающие при дробле-
нии цитоплазму с данным веществом, становятся предшественниками половых клеток, и их потомки дают начало гаметам. Показано, что у зародышей ряда других животных, раннее развитие которых является в основном регуляционным и определяется межклеточными взаимодействиями, обнаруживаются подобные половые детерминанты. Содержащие их бластомеры в ходе дальнейшего развития дают начало предшественникам гамет и мигрируют в закладку гонад.
Помимо овоплазматической сегрегации, гетерогенность яйцеклетки определяется также неоднородностью организации ее плазмалем-мы. Так, для овулировавших яйцеклеток млекопитающих характерна своеобразная организация цитоскелета, что в свою очередь приводит к мозаичной организации плазматической мембраны. Основная часть мембраны яйцеклетки образует микроворсинки, и лишь примерно от одной десятой до одной пятой общей поверхности яйцеклетки мыши представлено районом, в котором нет микроворсинок. Под плазма-леммой в этой области яйцеклетки располагается густая сеть микро-филаментов, а глубже находится мейотическое веретено метафазы II. У других млекопитающих район, не имеющий микроворсинок, также соответствует той области цитоплазмы, где располагается мейотическое веретено.
При оплодотворении спермий контактирует с мембраной яйцеклетки в любом месте, богатом микроворсинками. После этого микроворсинки исчезают, генетический материал спермия попадает в цитоплазму яйцеклетки, а часть мембраны спермия встраивается в месте его проникновения в мембрану яйцеклетки. В результате возникает разнородность плазматической мембраны, которая отражается на нескольких делениях дробления. Первые два бластомера имеют одинаковый размер, но не вполне одинаковые характеристики. Во время интерфазы синтез рибосомальной РНК в ядрышках этих бластомеров происходит в разное время, продолжительность фазы репликации ДНК у них также неодинакова. Один из бластомеров содержит в плазмалемме антигены, а в цитоплазме — структурные компоненты хвоста спермия. Предполагается, что именно этот бластомер вступает во второе деление дробления на 20-60 мин раньше другого. Мембранные антигены спермия сохраняются в плазмалеммах у потомков этого бластомера еще на протяжении нескольких делений. Установлено, что потомки именно этого бластомера, который на 2-клеточной стадии делится первым, с большей вероятностью дадут начало развитию внутренней клеточной массы бла-стоцисты, тогда как потомки запаздывающего при делении бластомера с
большей вероятностью станут источником для формирования внезаро-дышевых частей эмбриона.
Таким образом, гетерогенность яйцеклетки не только определяет последующую дифференцировку клеток зародыша, но и обеспечивает развитие зародыша как единой системы.