Методы изучения генетики человека

Цель. Изучить методы медицинской генетики. Уметь составлять родословные, устанавливать тип наследования признака и прогнозировать наследственные заболевания у потомства. Знать методы исследования кариотипа, хромосомные болезни, обусловленные нарушением числа и структуры хромосом. Уметь выявлять соотносительную роль генетических и средовых факторов в формировании признака. Знать основы генетики популяций, уметь рассчитать частоты генов и генотипов в популяции. Изучить современные методы молекулярной генетики.

Человек как объект генетических исследований обладает рядом особенностей, представляющих трудности для изучения: к нему не применим метод экспериментальной гибридизации, у человека немногочисленное потомство, не всегда возможно одновременное обследование трех и более поколений семьи. Вместе с тем генетический анализ у человека существенно облегчается благодаря высокой степени изученности у него морфологических, биохимических, физиологических, молекулярных и других процессов. Учитывая все эти особенности, генетиками разработаны приемы и методы, позволяющие изучать закономерности наследственности и изменчивости у людей, роль наследственных и средовых факторов в возникновении болезней, мутагенез, распространение мутантных генов в человеческих популяциях, молекулярно-генетические процессы у человека.

Один из первых методов генетики человека – генеалогический, предложенный в конце XIX века Ф. Гальтоном, основан на составлении родословных. Несмотря на появление новых современных методов, анализ родословных не потерял своей актуальности и успешно применяется для установления наследственного характера признака и типа наследования. Значительного прогресса в области генетики человека удалось достигнуть в 50-е годы XX столетия, когда были разработаны методы изучения кариотипа. Именно в это время выявлены и охарактеризованы основные синдромы трисомий по аутосомам и половым хромосомам. Однако революционный прорыв в генетических исследованиях стал возможен благодаря молекулярно-генетическим методам. В этой области важным достижением стала разработка методов секвенирования, т.е. определения последовательности нуклеотидов в ДНК человека. В начале XXI века была завершена международная программа «Геном человека», результатом которой было секвенирование 3 млрд пар ну-

клеотидов и идентификация большинства генов. Показано, что общее число генов у человека составляет около 30000, что намного меньше, чем предполагалось ранее, и всего в два раза больше, чем число генов у плодовой мушки-дрозофилы или микроскопического круглого червя – почвенной нематоды. Из общего количества генов более 20 тыс. идентифицировано, примерно половина из них картирована на индивидуальных хромосомах. Использование молекулярных подходов позволило не только картировать гены, но и идентифицировать в них основные типы мутаций, обуславливающих развитие наследственных заболеваний. К настоящему времени картировано более 1000 генов человека, контролирующих возникновение той или иной патологии, большая часть этих генов клонирована. Сейчас перед генетиками стоят задачи идентификации новых генов, выяснения их функций, разработки методов генной терапии с целью исправления генетических дефектов.

Задание для студентов

Работа 1. Методы генетики человека

Изучите и перепишите таблицу.

Методы генетики человека

Цель и возможности метода

1. Генеалогический

Оценка наследственной обусловленности признака, определение характера и типа наследования, прогнозирование заболеваний потомства, изучение интенсивности мутационного процесса, экспрессивности и пенетрантности аллеля

2. Цитогенетический

Изучение кариотипа человека в норме и патологии, строения отдельных хромосом, полового хроматина. Диагностика хромосомных болезней, связанных с изменением числа и структуры хромосом. Экспрессметод определения полового хроматина, показывающего изменение числа половых хромосом

3. Близнецовый

Изучение закономерностей наследования в парах одно- и разнояйцовых близнецов. Определение соотносительной роли наследственности и среды в формировании признака или заболевания. Выявление пенетрантности аллеля, оценка действия на организм внешних факторов

Окончание табл.

Методы генетики человека

Цель и возможности метода

4. Популяционностатистический

Определение частот встречаемости аллелей и генотипов в популяции, изучение генетической структуры популяции. Оценка распространения наследственных болезней в популяциях человека

5. Биохимический

Изучение наследственных заболеваний, обусловленных генными мутациями. Обнаружение дефектов ферментов, структурных и транспортных белков, вызывающих врожденные болезни обмена веществ

6. Дерматоглифика

Изучение кожных узоров пальцев и ладоней для диагностики хромосомных болезней

7. Метод генетики соматических клеток

Изучение наследственности и изменчивости соматических клеток, регуляции генной активности, патогенеза на клеточном уровне. Определение локализации и механизмов действия генов, групп сцепления генов

8. Иммунологический

Изучение генов, отвечающих за болезни иммунной системы, тканевую совместимость, эритроцитарные факторы групп крови (АВ0; резус-фактор и др.)

9. Методы

моделирования

Изучение механизмов развития наследственных болезней у человека с помощью мутантных линий животных, имеющих сходные нарушения

10. Клонирование

Получение клонов клеток, тканей, органов, организмов из соматических клеток. Представляет возможность использования стволовых эмбриональных клеток в качестве материала для трансплантации. Является основой биологического конструирования на уровне отдельных тканей, органов и организмов

11. Молекулярногенетические методы. Генная инженерия

Изучение последовательности нуклеотидов в ДНК (секвенирование); картирование генов, идентификация мутаций; гибридизация с ДНК-зондами и возможность диагностики наследственных заболеваний; создание геномных библиотек; получение рекомбинантных ДНК

Работа 2. Генеалогический метод

Изучите символы, наиболее часто используемые при составлении родословных.

Изучите и перепишите особенности родословных при различных типах наследования (рис. 1-5).

I. Для родословных при аутосомно-доминантном типе наследования характерно:

•  при достаточном числе потомков признак обнаруживается в каждом поколении;

•  наследуется признак примерно половиною детей;

•  потомки мужского и женского пола наследуют признак одинаково часто;

•  оба родителя в равной мере передают признаки детям.

Рис. 1. Родословная семьи с несовершенным амелогенезом (нарушение формирования эмали зубов, гипокальцификация эмали)

Пробанд (IV – 3), ее брат (IV – 2) унаследовали заболевание от отца (III – 4). Все члены семьи, имеющие признак, гетерозиготны по гену несовершенного амелогенеза. Степень риска проявления признака в потомстве пробанда составляет 50\%.

II. Для родословных при аутосомно-рецессивном типе наследования характерно:

•  признак может отсутствовать в поколении детей, но проявляется у внуков;

•  признак может проявляться у детей при отсутствии его у родителей;

•  признак наследуется всеми детьми, если оба родителя имеют его;

•  признак наследуется потомками мужского и женского пола одинаково часто.

Пробанд (IV – 3), его сестра (IV – 2), ее прадед (I – 2) больны галактоземией. Мать и отец пробанда (III – 3 и III – 4) двоюродные сибсы, гетерозиготны по гену галактоземии и унаследовали его от своих родителей. Степень риска проявления галактоземии в потомстве пробанда равна:

– 0 при условии отсутствия гена галактоземии у жены пробанда;

– 50\%, если жена пробанда гетерозиготна по гену галактоземии.

Рис. 2. Родословная семьи с галактоземией (дефицит фермента расщепляющего лактозу, накопление продуктов неполного распада лактозы)

III. Для родословных при Х-сцепленном доминантном типе наследования характерно:

•  при достаточном числе потомков признак обнаруживается в каждом поколении;

•  признак прослеживается и у мужчин и у женщин, но женщины имеют его чаще;

•  мужчины могут наследовать признак только от матери;

•  женщины передают признак половине дочерей и половине сыновей;

•  мужчины передают признак всем дочерям и не передают ни одному из сыновей.

Рис. 3. Родословная семьи с рахитом, резистентным к витамину D (нарушение фосфорно-кальциевого гомеостаза)

Пробанд (IV – 5), его сестра (IV – 7) унаследовали ген рахита от матери (III – 13). У деда (II – 8) и двоюродного деда (II – 2) пробанда все дочери имеют рахит, все сыновья здоровы. Степень риска заболевания рахитом в потомстве пробанда равна 0 среди сыновей и 100\% среди дочерей.

IV. Для родословных при Х-сцепленном рецессивном типе наследования характерно:

•  признак проявляется преимущественно у гемизиготных мужчин;

•  у женщин признак проявляется лишь в гомозиготном состоянии;

•  у гетерозиготных матерей примерно половина сыновей имеет признак, а половина дочерей – носители;

•  у гемизиготных мужчин все дочери являются гетерозиготными носителями.

Пробанд (III – 3), его дядя (II – 7) больны гемофилией. Мать (II – 6) и бабушка пробанда (I – 3) здоровы, но являются гетерозиготными носителями гена гемофилии. Степень риска проявления в потомстве пробанда гемофилии равна:

– 0 при условии отсутствия гена гемофилии у будущей жены пробанда;

– 50\% больных среди девочек и 50\% среди мальчиков при наличии гена гемофилии у будущей жены пробанда.

Рис. 4. Родословная с гемофилией А

V. Для родословных при Y-сцепленном типе наследования характерно:

•  фенотипическое проявление у лиц мужского пола;

•  передача признака осуществляется от отца к сыну;

•  среди сыновей распространение признака в 100\% случаев.

Рис. 5. Родословная при голандрическом типе наследования гипертрихоза ушной раковины

Пробанд (V – 4), его брат (V – 5), отец (IV – 6), дяди (IV – 4 и IV – 7), дед (III – 3), прадед (II – 2), прапрадед (I – 2) имеют в У хромосоме ген гипертрихоза. Вероятность проявления этого признака в потомстве пробанда равна 100\% среди сыновей.

Работа 3. Анализ родословных

В представленных родословных определите:

– тип наследования признака;

– генотипы членов семьи;

– степень риска проявления признака в потомстве пробанда.

Работа 4. Составление родословных

1. Пробанд – мужчина, имеющий заболевание – несовершенный дентиногенез (нарушение формирования твердых тканей зубов). Жена пробанда не имеет этой аномалии. У них трое детей: девочка с несовершенным дентиногенезом и два мальчика без аномалии дентина. Мать пробанда не имеет этого заболевания, а отец – с несовершенным дентиногенезом. По линии отца пробанд имеет двух теток без аномалий дентина, одну тетю и дядю с несовершенным дентиногенезом. Тетя, имеющая несовершенный дентиноге-

нез, замужем за мужчиной без этой аномалии. У них есть дочь с несовершенным дентиногенезом. Тетя пробанда, не имеющая аномалий дентина, замужем. Ее муж, два сына и две дочери – без аномалий дентина. Дядя с несовершенным дентиногенезом женат на женщине без аномалий дентина. У него два сына без аномалий дентина и дочь с несовершенным дентиногенезом. Дедушка по линии отца пробанда имел это заболевание, а бабушка не имела. Составьте родословную, определите тип наследования заболевания и генотип пробанда.

2. Нарушение прикуса является составляющей частью многих наследственных синдромов, имеющих различные типы наследования: аутосомно-доминантный, аутосомно-рецесивный, Х-сцепленный. В семье пробанд – женщина, имеющая синдром с нарушением прикуса. У нее два здоровых брата и сестра с синдромом, сопровождающимся нарушением прикуса. Мать пробанда здорова, отец пробанда здоров и является двоюродным братом своей жены. Дедушка пробанда со стороны отца и бабушка пробанда со стороны матери – родные сестра и брат – здоровы. Общий дед отца и матери пробанда имеет синдром с нарушением прикуса. Общая бабка не имеет этой аномалии. У матери пробанда здоровая сестра замужем за здоровым мужчиной. Сын и дочь от этого брака, двоюродные сибсы пробанда, здоровы. Отец имеет здоровых двух братьев и двух сестер. Составьте родословную и определите тип наследования синдрома в данной семье.

3. Агенезия зубов (врожденное отсутствие одного или более зубов) может наследоваться по аутосомно-доминантному, аутосомнорецессивному и Х-сцепленному типам. В приведенной ниже родословной прослеживается наследование одной из форм агенезии – отсутствие вторых премоляров и третьих моляров. Пробанд – мужчина имеет агенезию зубов. У брата пробанда и отца пробанда этой аномалии не отмечено. Мать пробанда с агенезией зубов имеет трех сестер: две сестры с агенезией зубов и одна без аномалии. Все сестры матери пробанда замужем, их мужья без аномалии зубов. Одна из теток со стороны матери пробанда с агенезией зубов имеет сына с агенезией зубов. У второй тети с агенезией зубов – сын и дочь с агенезией и дочь без аномалии зубов. Третья тетка со стороны матери без аномалии зубов имеет двух сыновей и одну дочь с нормальным количеством зубов.

Дед пробанда по линии матери и двое его братьев имели агенезию зубов, и еще двое братьев были без этой аномалии. Отец деда со стороны матери пробанда также имел агенезию зубов, у его жены этой аномалии не было. Составьте родословную и определите тип наследования агенезии этого типа, генотип пробанда. 4. Здоровые муж и жена – двоюродные сибсы имеют больного диабетом ребенка. Мать мужа и отец жены (родные сибсы) – здоровы. Брат мужа и две сестры жены здоровы. Общий дядя супругов тоже здоров. Их общая бабка была здорова, а дед страдал диабетом. Все родственники со стороны отца мужа: два дяди, двоюродная сестра, дед и бабка – здоровы. Все родственники со стороны матери жены: тетка, двоюродный брат, дед и бабка – здоровы. Определите тип наследования диабета и отметьте членов семьи, гетерозиготных по гену диабета.

Работа 5. Принципы ориентировочной идентификации хромосом. Денверская классификация хромосом человека

В основу существующей унифицированной классификации хромосом (г. Денвер, 1960) положены различия в длине хромосом и расположении центромеры. На основании различий в длине выделены 23 пары хромосом. Существуют группы метацентрических, субметацентрических и акроцентрических хромосом. Отношение хромосом к тому или иному типу производится на основе расчета центромерного индекса – отношение длины короткого плеча к длине всей хромосомы. В группе метацентрических хромосом короткие и длинные плечи приблизительно равны и центромерный индекс приближается к 0,5, в субметацентрических хромосомах он составляет от 0,25 до 0,35, в акроцентрических не превышает 0,2.

Используя разборную модель кариотипа, расположите пары гомологичных хромосом в порядке убывания их длины с учетом расположения центромер. Выделите 7 групп хромосом. Оцените диагностические возможности такого хромосомного анализа.

Изучите и перепишите таблицу.

Группа

? пар хромосом

Характеристика группы хромосом

A

1, 2, 3

Самые крупные метацентрические

B

4, 5

Крупные субметацентрические

C

6, 7, 8, 9, 10, 11, 12

Средних размеров метацентрические и субметацентрические

D

13, 14, 15

Относительно крупные акроцентрические со спутниками

E

16, 17, 18

Мелкие метацентрические и субметацентрические

F

19, 20

Самые мелкие метацентрические

G

21, 22

Самые мелкие акроцентрические со спутниками

Половые хромосомы

X

Средних размеров субметацентрическая (близка к хромосоме ? 6)

Y

Самая мелкая акроцентрическая (близка к хромосоме ? 21 и ? 22)

Работа 6. Кариотип человека

Рассмотрите постоянный цитогенетический препарат соматических клеток человека (культура лейкоцитов или эмбриональных фибробластов). При увеличении объектива 40 найдите пригодную для анализа метафазную пластинку, в которой все хромосомы четко прокрашены и не накладываются друг на друга. Переведите увеличение на 90 с иммерсией, сосчитайте число хромосом, определите сочетание половых хромосом и пол донора клеток, учитывая, что в мужском кариотипе Y-хромосома – маленький акроцентрик и всего малых акроцентрических хромосом 5, тогда как в женском кариотипе только 4 малых аутосомных акроцентриков.

Работа 7. Дифференциальное окрашивание метафазных хромосом человека

Специальные методы окрашивания и обработки хромосом позволяют проводить их точную идентификацию и выявлять структурные перестройки.

На фотографиях препаратов метафазных пластинок, подвергнутых воздействию различных красителей, температур, солевых растворов,

флюорохромов, изучите рисунок поперечной исчерченности по длине хромосом. Расположение и толщина темных и светлых полос строго индивидуальны для каждой хромосомы.

Зарисуйте схему сегментации Х-хромосомы человека, показывающую расположение полос, при дифференциальном окрашивании (в соответствии с номенклатурой ISCN – 1995).

Работа 8. Хромосомные болезни

Изучите и перепишите таблицу.

Хромосомные болезни

Кариотип

Наиболее характерные клинические проявления

I. Моносомии

Синдром

Шерешевского-

Тернера

45, X0

Фенотип женский. Низкий рост. Короткая шея со складками кожи, идущими от затылка («шея» сфинкса), деформированные ушные раковины, уменьшенный подбородок. Отсутствие или недоразвитие половых признаков, пороки внутренних органов (особенно часто – почек)

II. Трисомии

Синдром Патау (трисомия 13)

47, 13+

Множественные уродства: микроцефалия, аномалии глазного яблока, незаращение губы и нёба, полидактилия. Врожденные пороки внутренних органов: сердца, почек, желудочнокишечного тракта. Гибель в первые недели или месяцы

Окончание табл. 3

Хромосомные болезни

Кариотип

Наиболее характерные клинические проявления

Синдром Эдвардса (трисомия 18)

47, 18+

Голова, расширяющаяся к затылку. Низко расположенные деформированные уши, недоразвитие нижней челюсти. Пороки внутренних органов. Смерть наступает в 2-3 мес жизни

Синдром Дауна (трисомия 21)

47, 21+

Невысокий рост, небольшая круглая голова со скошенным затылком, близко расположенные глаза, эпикант, короткий широкий нос, полуоткрытый рот с высунутым языком. Слабоумие. Пороки внутренних органов, особенно часто нарушения сердечно-сосудистой системы

Синдром Трипло-X

47, XXX

Состояние, пограничное между нормой и патологией. Часто отмечается недоразвитие яичников, матки, бесплодие. Незначительное снижение интеллекта

Синдром Кляйнфельтера

47, XXY

Мужской фенотип. Высокий рост, евнухоидные пропорции тела, строение скелета по женскому типу, гинекомастия. Недоразвитие половых органов, бесплодие

III. Синдромы, обусловленные делециями хромосом

Синдром Вольфа (делеция короткого плеча 4 хромосомы)

46, 4p-

Низко расположенные деформированные уши, аномалии губы и нёба, широкий уплощенный нос. Задержка умственного и физического развития. Врожденные пороки внутренних органов

Синдром «кошачьего крика» (делеция короткого плеча 5 хромосомы)

46, 5p-

Название от специфического плача детей, обусловленного аномалией гортани. Луноподобное лицо, эпикант, маленькая челюсть, низко расположенные уши. Задержка умственного развития. Пороки мозга, сердца, почек, крипторхизм

Хронический миелолейкоз (делеция длинного плеча 21-й или 22-й хромосомы)

46,

21q-

46, 22q-

Нарушено кроветворение. Аномалия отмечается в линии кроветворных клеток, другие соматические клетки больного имеют нормальный кариотип

Работа 9. Близнецовый метод в генетических исследованиях

Близнецовые исследования включают определение конкордантности пар и коэффициента наследуемости, показывающего соотносительную роль генетических и средовых факторов в развитии признака.

Конкордантность (С) – показатель идентичности близнецовой пары по определенному признаку, вычисляется по формуле:

где: CMZ – конкордантность в парах монозиготных близнецов; CDZ – конкордантность в парах дизиготных близнецов; n – число пар близнецов соответствующей группы, у которых признак отмечен у обоих партнеров; N – общее число обследуемых близнецовых пар этой же группы.

Используя данные таблицы (см. ниже), вычислите коэффициент наследуемости (Н) по формуле Хольцингера для приведенных в таблице признаков:

При Н > 0,7 – решающая роль в проявлении признака принадлежит наследственным факторам; при Н=0,3-0,7 – на проявление признака оказывают влияние как наследственные, так и средовые факторы; при Н < 0,3 – основная роль принадлежит факторам внешней среды.

Перепишите таблицу и укажите, какой из факторов – наследственный или средовой – играет решающую роль в проявлении каждого из перечисленных признаков.

Работа 10. Изучение распространения некоторых менделирующих признаков в популяциях человека

Подсчитайте число студентов в группе:

1) способных складывать язык трубочкой (аутосомно-доминантный признак) и не способных складывать язык трубочкой (аутосомнорецессивный признак);

2) имеющих свободную мочку уха (аутосомно-доминантный признак) и приросшую мочку уха (аутосомно-рецессивный признак).

Полученные данные внесите в таблицу и с учетом некоторых допущений рассчитайте генетический состав популяций.

Признаки

Число лиц

аа на 100 человек (q2)

q

p

АА на 100 человек (p2)

Аа (2pq)

1. Складывание языка трубочкой Неспособность к складыванию

           

2. Свободное прикрепление мочки уха Приросшая мочка уха

           

Работа 11. Определение генетической структуры популяций Решите задачи

1. В популяциях людей, населяющих Европу, на 40 000 человек встречается 1 альбинос. Определите генетическую структуру популяции, если известно, что альбинизм – рецессивный признак.

2. Рахит витамин-Б-зависимый сопровождается типичными для рахита признаками, а также задержкой прорезывания зубов, гипоплазией эмали и ранним кариесом. Наследование аутосомно-рецессивное. В одном из районов Канады частота встречаемости гена рахита очень высока и составляет 4/100. Вычислить частоту встречаемости гомо- и гетерозигот в этом районе.

3. Таудентизм «бычий зуб» – аномалия развития зуба, характеризующаяся большой пульповой камерой. Наследование аутосомнодоминантное. В одной из стран Европы заболевание встречается с частотой 1\%. Определите возможное количество людей, гомозиготных по рецессивному гену, в городе, включающем 10 000 жителей.

4. При несоответствии генотипов матери и плода по группе крови (мать – Rh-, плод – Rh+) у новорожденных может проявиться тяжелая гемолитическая болезнь, связанная с разрушением эритроцитов и приводящая к гибели. Рассчитайте частоту гомо- и гетерозигот Rh+, если известно, что Rh- лица встречаются с частотой, близкой к 16\%, и вычислите частоту резус-конфликтных беременностей в панмиксической популяции.

5. Врожденный вывих бедра наследуется доминантно, средняя пенетрантность 25\%, заболевание встречается с частотой 6 : 10 000. Определите число гомозигот по рецессивному гену.

Работа 12. Молекулярно-генетические методы

Молекулярно-генетические методы используются для изучения генома, структуры и функции генов, последовательности нуклеотидов в гене, генных мутаций. С помощью анализа ДНК можно выявить патологические гены, диагностировать болезни, определить заболевание пренатально, выявить гетерозиготное носительство.

Исходным этапом всех молекулярно-генетических исследований является получение ДНК. Хромосомную ДНК можно выделить из любых ядросодержащих клеток, чаще всего у человека для этой цели используют лейкоциты крови. Получение ДНК включает несколько этапов: быстрый лизис клеток, удаление фрагментов клеточных органелл, ферментативное разрушение и экстрагирование белков, осаждение молекул ДНК в этаноле с последующим их растворением в буферном растворе. К наиболее важным методам молекулярной генетики, лежащим в основе геномных технологий и ДНК-диагностики, относятся: рестрикция ДНК, полимеразная цепная реакция (ПЦР), гибридизация с ДНК-зондами, клонирование, секвенирование.

Изучите данные таблицы.

Более подробное изложение молекулярно-генетических методов см. в Приложении.

Приложение

Рестрикция ДНК

Получить фрагмент геномной ДНК с целью последующего изучения можно путем рестрикции ДНК. Выделенная из клеток органов ДНК подвергается расщеплению рестрикционными эндонуклеазами (рестриктазами). Это ферменты бактериального происхождения, участвующие в распознавании чужеродных молекул ДНК и их уничтожении. Каждый такой фермент способен узнавать в любой двухцепочечной молекуле ДНК специфическую последовательность из 4-12 нуклеотидов. Такие последовательности часто являются палиндромными, т.е. последовательности нуклеотидов в них читаются в обоих направлениях одинаково. Две цепи ДНК разрезаются в участке узнавания или вблизи от него, причем цепи во многих случаях разрезаются не прямо друг против друга, а наискосок, образуя в результате «липкие» концы. Эти одноцепочечные концевые участки способны образовывать комплементарные пары оснований с любыми другими

одноцепочечными концевыми участками, полученными с помощью того же фермента.

Известно более 500 различных типов рестриктаз, каждая из которых способна разрезать молекулу ДНК в определенном месте – сайте рестрикции. Длина рестрикционных фрагментов зависит от распределения сайтов в исходной молекуле ДНК: чем чаще расположены сайты, тем образующиеся фрагменты короче. В зависимости от частоты расположения сайтов рестрикции выделяют три класса рестриктаз: частощепящие, узнающие короткие специфические последовательности длиной в 4-5 нуклеотидов, среднещепящие, узнают последовательности 6-7 пар нуклеотидов, редкощепящие, узнают последовательности 8-12 пар нуклеотидов.

После обработки участка ДНК несколькими рестриктазами образуются рестрикционные фрагменты, и с помощью специального анализа можно определить расположение этих фрагментов относительно друг друга в молекуле ДНК, т.е. построить рестрикционную карту.

Рис. 1. Схема рестрикции ДНК

Полимеразная цепная реакция

В генетических исследованиях в ряде случаев необходимо изучить небольшой фрагмент ДНК. Для этого должно быть достаточное коли-

чество копий фрагмента, т.е. фрагмент необходимо «размножить», или амплифицировать.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) (рис. 2) – метод амплификации фрагментов ДНК in vitro, позволяющий получить огромное число копий за счет постоянно повторяющихся циклов синтеза исследуемого фрагмента ДНК.

Рис. 2. Схема полимеразной цепной реакции (ПЦР) [Mullis K., 1990]

Для проведения ПЦР необходимы: исследуемый фрагмент ДНК, два искусственно синтезированных праймера – олигонуклеотидных последовательностей ДНК длиной до 30 нуклеотидов, четыре вида дезоксирибонуклеотидов и термостабильная ДНК-полимераза, сохраняющая свою активность при температуре 94 °С.

ПЦР состоит из повторяющихся циклов, в каждом из которых выделяют три этапа. На первом этапе исходный фрагмент молекулы ДНК нагревают до температуры 94 °С. В результате водородные связи, соединяющие комплементарные цепи, разрушаются и образуются одноцепочечные формы. На втором этапе реакционную смесь охлаждают до температуры 37-68 °С в присутствии двух праймеров. Один праймер комплементарен участку ДНК слева от изучаемого фрагмента, второй – участку другой нити справа от изучаемого фрагмента. Праймеры ориентированы З’-концами навстречу друг другу. Длина амплифицируемого фрагмента определяется расстоянием между праймерами. На третьем этапе при участии ДНК-полимеразы происходит синтез последовательности, комплементарной матричной ДНК при температуре 72 °С.

В следующем цикле реакционную смесь с полученными нитями ДНК вновь прогревают, и синтезированные нити ДНК используют в качестве матрицы. Новые праймеры гибридизируются с соответствующими участками, и происходит синтез новых цепей.

При последующем изучении амплифицированных фрагментов ДНК путем электрофореза в агарозном или акриламидном геле возможно выявление мутаций. Электрофорез позволяет разделить фрагменты ДНК с разной молекулярной массой. Небольшие по размеру и молекулярной массе фрагменты продвигаются легче сквозь поры в геле, и длина пробега у них будет больше по сравнению с крупными. Если происходит мутация, связанная с изменением длины фрагмента ДНК – делеция или инсерция, то на электрофореграмме выявляется изменение положения фрагмента по сравнению с нормой (рис. 3).

Рис. 3. Схема опыта по анализу фрагментов ДНК:

М – маркер молекулярной массы фрагментов ДНК; 1 – нормальный образец ДНК; 2 – изучаемый мутантный образец ДНК

Гибридизация с ДНК-зондами

С помощью этого метода возможны идентификация специфических нуклеотидных последовательностей ДНК, определение положения гена, диагностика генных болезней, картирование хромосомных перестроек.

ДНК-зонд представляет одноцепочечную ДНК с известной последовательностью нуклеотидов длиной до 30 нуклеотидов. Зонд используется для поиска комплементарных последовательностей в молекуле большего размера.

Фрагменты исследуемой ДНК получают с помощью рестрикционных эндонуклеаз и путем электрофореза разделяют по относительной молекулярной массе в агарозном геле. ДНК в геле денатурируют, т.е. переводят в одноцепочечные формы и переносят на плотный носитель (фильтр). Фиксированную на этом носителе ДНК гибридизируют с радиоактивно меченным ДНК-зондом. Зонд связывается с комплементарным фрагментом ДНК. Положение этого фрагмента на фильтре определяют методом автографии (на рентгеновской пленке выявляют участок засветки).

Гибридизацию с ДНК-зондами проводят и на хромосомных препаратах (гибридизация in situ). Меченный флюорохромами ДНК-зонд наносят на препараты дифференциально окрашенных и приготовленных для гибридизации (денатурированных) метафазных хромосом. После специфической обработки препарата места хромосомной локализации последовательностей ДНК, комплементарных ДНК-зондам, выявляются в виде характерных светящихся участков.

Методы гибридизации с ДНК-зондами и амплификация (ПЦР) с последующим анализом образцов ДНК лежат в основе ДНКдиагностики наследственных заболеваний человека. Основная задача ДНК-диагностики – исследование генов с целью выявления мутаций.

Рис. 4. Схема гибридизации с ДНК-зондами

Клонирование ДНК

Метод клонирования позволяет получать фрагменты ДНК любого происхождения в неограниченном количестве. Для клонирования в прокариотических клетках используют плазмиды и фаги, в эукариотических клетках – дрожжевые плазмиды.

Плазмиды представляют небольшие кольцевые молекулы двухцепочечной ДНК, которые часто несут жизненно важные для клетки гены, например гены устойчивости к антибиотикам. Присутствие таких генов-маркеров позволяет использовать плазмиды в геномных технологиях.

На первом этапе клонирования плазмидную ДНК выделяют из клеток и используют в качестве вектора клонирования. С помощью рестрикционной эндонуклеазы плазмидную ДНК разрезают в одной точке и встраивают в нее фрагмент ДНК, который необходимо клонировать. Образующуюся при этом гибридную (рекомбинантную) ДНК вводят в бактериальную клетку-хозяина. Предварительно производят специальную обработку клеток-хозяев для того, чтобы на короткое время они стали проницаемы для макромолекул. Плазмиды проникают только в некоторые из обработанных клеток. На следующем этапе эти клетки легко выделяют в селективной среде, так как только они могут расти в присутствии антибиотиков, поскольку вместе с плазмидой получили соответствующий ген устойчивости. Далее клетки, содержащие рекомбинантную ДНК, размножают (собственно клонирование). При их делении плазмиды также реплицируются, образуя огромное количество копий исходного фрагмента ДНК. В конце периода пролиферации из клеток выделяют гибридные молекулы плазмидной ДНК и, обрабатывая их повторно той же рестриктирующей эндонуклеазой, вырезают копии исходных фрагментов ДНК. При необходимости индуцируют экспрессию клонированного фрагмента ДНК (гена) и получают кодируемый им белок.

Коллекция клонов ДНК, содержащая хотя бы по одному экземпляру каждого из фрагментов ДНК, входящих в состав генома данного вида, называется геномной библиотекой.

Рис. 5. Схема клонирования

Вопросы для самоподготовки

1. Цели и возможности генеалогического метода. Чем характеризуются родословные при различных типах наследования?

2. Что такое кариотип? Как изучают кариотип человека?

3. Назовите известные классификации хромосом. Что позволяет определить дифференциальное окрашивание хромосом по сравнению с рутинной окраской?

4. Что такое половой хроматин?

5. Назовите хромосомные болезни, обусловленные изменением числа аутосом, половых хромосом, структуры хромосом.

6. В чем суть близнецового метода? Как определить конкордантность в парах близнецов?

7. Приведите формулу для вычисления коэффициента наследуемости, показывающего влияние среды и генотипа в развитии признака.

8. Назовите возможности биохимического метода в генетических исследованиях.

9. Приведите закон Харди-Вайнберга. Что характеризует идеальную и реальную популяцию?

10. Перечислите системы браков в человеческих популяциях. Какие возможны последствия близкородственных браков?

11. Что такое рестрикция ДНК? Охарактеризуйте действие рестрикта.

12. В чем суть полимеразной цепной реакции?

13. Какие методы молекулярной генетики лежат в основе ДНКдиагностики?

14. Что такое рекомбинация ДНК? Как производят клонирование

ДНК?

15. Задачи медико-генетического консультирования.

Тестовые задания

Выберите один правильный ответ.

1. В РОДОСЛОВНОЙ СЕМЬИ С БРАХИДАКТИЛИЕЙ

ОТМЕЧАЕТСЯ РАВНАЯ ВЕРОЯТНОСТЬ ВСТРЕЧАЕМОСТИ ДАННОЙ АНОМАЛИИ КАК У МУЖЧИН, ТАК И У ЖЕНЩИН. ПРИЗНАК ОБНАРУЖИВАЕТСЯ В КАЖДОМ ПОКОЛЕНИИ И НАСЛЕДУЕТСЯ ПРИМЕРНО ПОЛОВИНОЮ ДЕТЕЙ. ТИП НАСЛЕДОВАНИЯ БРАХИДАКТИЛИИ:

1. Аутосомно-доминантный

2. Аутосомно-рецессивный

3. Рецессивный Х-сцепленный

4. Y-сцепленный

2. КАРИОТИП ЧЕЛОВЕКА ПРЕИМУЩЕСТВЕННО ИЗУЧАЮТ

В ПЕРИОДЕ МИТОТИЧЕСКОГО ЦИКЛА:

1. Пресинтетическом

2. Синтетическом

3. Постсинтетическом

4. Метафазе митоза

5. Анафазе митоза

3. ДЕНВЕРСКАЯ КЛАССИФИКАЦИЯ ОСНОВАНА НА:

1. Дифференциальном окрашивании хромосом

2. Определении размеров хромосом и положении центромеры

3. Выявлении локализации генов и их комплексов

4. СООТНОСИТЕЛЬНУЮ РОЛЬ ГЕНОТИПА И СРЕДЫ

В ФОРМИРОВАНИИ ПРИЗНАКА МОЖНО ОПРЕДЕЛИТЬ С ПОМОЩЬЮ МЕТОДА:

1. Генеалогического

2. Биохимического

3. Близнецового

4. Цитогенетического

5. В ПОПУЛЯЦИЯХ ЧЕЛОВЕКА РЕЗУС-ОТРИЦАТЕЛЬНЫЕ ЛИЦА

ВСТРЕЧАЮТСЯ С ЧАСТОТОЙ 16\%.

ЧАСТОТА ВСТРЕЧАЕМОСТИ РЕЗУС-ПОЛОЖИТЕЛЬНЫХ ГОМОЗИГОТ В \%:

1. 36

2. 16

3. 4

4. 48

Выберите несколько правильных ответов.

6. С ПОМОЩЬЮ ГЕНЕАЛОГИЧЕСКОГО МЕТОДА ИЗУЧАЮТ:

1. Кариотип в норме и патологии

2. Тип и характер наследования признака

3. Экспрессивность и пенетрантность гена

4. Генетическую структуру популяций

5. Кожные узоры пальцев и ладоней

7. В РОДОСЛОВНОЙ ПРИ Х-СЦЕПЛЕННОМ ДОМИНАНТНОМ ТИПЕ НАСЛЕДОВАНИЯ, МУЖЧИНЫ ПЕРЕДАЮТ ПРИЗНАК:

1. Всем дочерям

2. Всем сыновьям

3. Ни одному из сыновей

4. Половине дочерей и половине сыновей

5. Мужчины в родословной имеют признак чаще, чем женщины

8. ЗАБОЛЕВАНИЯ ОБМЕНА ВЕЩЕСТВ, ВЫЗВАННЫЕ ГЕННЫМИ МУТАЦИЯМИ, МОЖНО ВЫЯВИТЬ МЕТОДАМИ:

1. Близнецовым

2. Биохимическим

3. Молекулярно-генетическим

4. Популяционно-статистическим

5. Генеалогическим

9. РОДСТВЕННЫЕ БРАКИ В ИЗОЛИРОВАННОЙ ПОПУЛЯЦИИ

ПРИВОДЯТ К:

1. Увеличению по многим локусам гетерозиготности

2. Утрате гетерозиготности

3. Росту гомозигот по локусам рецессивных аллелей

4. Повышению вероятности детской смертности

5. Повышению жизнеспособности потомков

Установить соответствие. 10. КАРИОТИП:

1. 47, XXY

2. 47, XXX

3. 45, X0

СИНДРОМ:

а) Дауна

б) Кляйнфельтера

в) Трипло-Х

г) Шерешевского-Тернера

д) Эдвардса

Литература

Основная

Биология: в 2-х кн. / Под ред. В.Н. Ярыгина. – М.: Высшая школа,

2005.

Дополнительная

Жимулев И.Ф. Общая и молекулярная генетики. – Н.: Сибирское университетское изд-во, 2003.

Геномика – медицине: Научное издание / Под ред. В.И. Иванова. – М.: Академкнига, 2005.

Рейтинг
( Пока оценок нет )
Понравилась статья? Поделиться с друзьями:
yamedik
Добавить комментарий
Adblock
detector