Эмбриогенез (от греч. етbryоп — зародыш), или эмбриональный период, начинается со слияния мужских и женских половых клеток, которые представляют собой процесс оплодотворения яйцеклеток.
У организмов, для которых характерно внутриутробное развитие, эмбриональный период заканчивается рождением, а у организмов, которым свойственны личиночный и неличиночный типы рзвития, эмбриональный период завершается выходом организма из яйцевых или зародышевых оболочек соответственно. В пределах эмбрионального периода различают стадии зиготы, дробления, бластулы, образования зародышевых листков, гистогенеза и органогенеза.
Зигота. Оплодотворение заключается в серии процессов, в которых мужская половая клетка инициирует развитие яйцеклетки. В активированной мужской гаметой яйцеклетке происходит ряд физических и химических процессов, включая повышенный синтез белков. Перемещение протоплазмы ведет к установлению билатериальной симметрии яйцеклетки. Ядра сливаются, восстанавливается диплоидный набор хромосом. Таким образом создается одноклеточный организм.
Дробление. Представляет собой начальный период развития зиготы (оплодотворенного яйца), которое заключается в делении зиготы путем митоза. Деление начинается с появления на поверхности яйцеклетки борозды. Первая борозда приводит к образованию двух клеток — двух бластомеров, вторая — четырех бластомеров, третья — восьми бластомеров (рис. 25). Группа клеток, образованная в результате последовательных дроблений, получила название морулы (от лат. morum — тутовая ягода).
Биологическое значение этой стадии заключается в том, что из крупной клетки, являющейся яйцеклеткой, образуются более мелкие клетки, в которых уменьшено отношение цитоплазмы к ядру.
Дробление зиготы завершается образованием многоклеточной структуры, получившей название бластулы (от греч. blastos — росток). Эта структура имеет форму пузырька, называемого бластодермой и состоящего из одного слоя клеток. Теперь эти клетки называют эмбриональными. По размерам бластула сходна с яйцеклеткой. В период дробления увеличивается количество ядер и общее число ДНК. Синтезируется также небольшое количество мРНК и тРНК, тогда как рибосомная РНК еще не обнаруживается.
Стадию бластулы проходят все животные, но в каждом случае есть особенности. У млекопитающих деление идет неравномерно, поэтому морулы состоят из разного количества клеток. Кроме того, из части клеток образуется структура, называемая трофобластом,
5
Бластоцель Личинка Головастик
форма
Рис. 25. Дробление зигот и образование бластул у разных организмов: 1 — исходная яйцеклетка; 2 — два бластомера; 3 — четыре бластомера; 4 — восемь бластомеров; 5 — бластула; 6 — взрослая форма
клетки которого питают зародыш и благодаря ферментам обеспечивают внедрение последнего в стенку матки. Позднее клетки трофобласта отслаиваются от зародыша и образуют пузырек, который заполняется жидкостью тканей матки.
Биологическое значение этой стадии заключается в том, что из крупной клетки, каковой является яйцеклетка, образуются более мелкие клетки, в которых уменьшено отношение цитоплазмы к ядру и ядро имеет новое цитоплазматическое окружение.
Гаструляция (от греч. gastre — полость сосуда). Это следующий за образованием бластулы процесс движения эмбриональных клеток, который сопровождается формированием двух или трех (в зависимости от вида животных) слоев зародыша, или так называемых зародышевых листков (рис. 26).
Развитие (гаструляция) изолецитальных яиц происходит путем инвагинации (впячивания) вегетативного полюса вовнутрь бластулы, в результате чего противоположные полюса почти сливаются, а бластоцель (полость бластулы) почти либо полностью исчезает. Внешний
Рис. 26. Гаструляция у различных организмов: 1 — бластоцель; 2 — первичная мезенхима; 3, 4, 5 — первичная кишка
слой клеток зародыша получил название эктодермы (от греч. ectos — снаружи, derma — кожа), или наружного зародышевого листка, тогда как внутренний — энтодермы (от греч. entos — внутри), или внутреннего зародышевого листка. Образующаяся при этом полость получила название гастроцеля, или первичной кишки, вход в которую называют бластопором (первичным ртом).
Развитие двух зародышевых листков характерно для губок и кишечнополостных. Однако хордовым в период гаструляции присуще развитие третьего зародышевого листка — мезодермы (от греч. mesos — средний), образующегося между эктодермой и энтодермой.
Гаструляция является необходимым пререквизитом для последующих стадий развития, поскольку она приводит клетки в положение, открывающее возможность формировать органы. Дифференцированный на три эмбриональных закладки зародышевый материал дает начало всем тканям и органам развивающегося зародыша.
Развитие (дифференцировка) зародышевых листков сопровождается тем, что из них формируются различные ткани и органы. В частности, из эктодермы развиваются эпидермис кожи, ногти и волосы, сальные и потовые железы, нервная система (головной мозг, спинной мозг, ганглии, нервы), рецепторные клетки органов чувств, хрусталик глаза, эпителий рта, носовой полости и анального отверстия, зуб-
ная эмаль. Из энтодермы развиваются эпителий пищевода, желудка, кишок, желчного пузыря, трахеи, бронхов, легких, мочеиспускательного канала, а также печень, поджелудочная железа, щитовидная, паращитовидные и зобная железы. Из мезодермы развиваются гладкая мускулатура, скелетные и сердечные мышцы, дерма, соединительная ткань, кости и хрящи, дентин зубов, кровь и кровеносные сосуды, брыжейка, почки, семенники и яичники. У человека первыми обособляются головной и спинной мозг. Через 2 месяца появляются почти все структуры тела. Связь зародыша со средой осуществляется через провизорные органы. Органогенез заканчивается к концу эмбрионального периода. Если дефинитивное ротовое отверстие образуется на месте первичного рта (бластопора), то этих животных называют первичноротыми (черви, моллюски, членистоногие).
Если же дефинитивный рот образуется в противоположном месте, то этих животных называют вторичноротыми (иглокожие, хордовые).
Для обеспечения связи зародыша со средой служат так называемые провизорные органы, которые существуют временно. В зависимости от типа яйцеклеток провизорными органами являются разные структуры. У рыб, рептилий и птиц к провизорным органам относится желточный мешок. У млекопитающих желточный мешок закладывается в начале эмбриогенеза, но не развивается. Позднее он редуцируется. Наружная оболочка эмбриона называется хорионом. Она врастает в матку. Место наибольшего врастания в матку называют плацентой. Зародыш с плацентой связан через пуповину, или пупочный кантик, в котором имеются кровеносные сосуды, обеспечивающие плацентарное кровообращение. Метаболизм плода обеспечивается через плаценту.
В основе формообразующего взаимодействия частей эмбриона лежат определенным образом скоординированные процессы обмена веществ. Закономерностью развития является гетерохронность, под которой понимают разное во времени образование закладок органов и различную интенсивность их развития. Быстрее развиваются те органы и системы, которые должны раньше начать функционировать. Например, у человека зачатки верхних конечностей развиваются быстрее, чем нижних.
Зародыши чрезвычайно чувствительны к разным воздействиям. Поэтому различают критические периоды, т. е. периоды, когда зародыши наиболее чувствительны к повреждающим факторам. В случае человека критическими периодами эмбрионального онтогенеза
являются первые дни после оплодотворения, время образования плаценты и роды.
Ядра соматических клеток способны обеспечивать нормальное развитие яйцеклеток, что было выяснено в экспериментах по пересадке ядер соматических клеток в яйцеклетки, лишенные ядер.
Эксперименты также показали, что трансформация отдельного бластомера из 8- и 16-клеточных эмбрионов овец одной породы в безъядерную половину яйцеклетки (после рассечения последней пополам) другой породы сопровождалась развитием жизнеспособных эмбрионов и рождением ягнят.
Со времен Гиппократа (V в. до н. э.) обсуждается вопрос о причинах, которые инициируют рождение плода. В частности, сам Гиппократ предполагал, что развитие плода инициирует собственное рождение. Новейшие экспериментальные работы английских исследователей, выполненные на овцах, показали, что у овец инициация окотов контролируется комплексом гипоталамус + гипофиз + надпочечники плодов. Повреждение ядер гипоталамуса, удаление передней доли гипофиза или надпочечников пролонгирует беременности овец. Напротив, введение овцам аденокортикотропного гормона (секрета передней доли гипофиза) или кортизола (секрета надпочечников) сокращает сроки их беременностей.
Довольно частым нарушением развития является разделение зародыша очень ранней стадии развития, что сопровождается развитием однояйцевых (монозиготных) близнецов (рис. 27). Известны и так называемые сиамские близнецы, представляющие собой неразделенные организмы. Неразделенность встречается разной — от незначительного соединения до почти полного слияния двух организмов с разделенными головами или ногами. Иногда из двух сиамских близнецов один нормален, но другой чрезвычайно изменен, будучи прикрепленным к нормальному, являясь, по существу, паразитом.
Итак, в процессе развития высших эукариотов одиночная оплодотворенная клетка-зигота в ходе дальнейшего развития в результате митоза дает начало клеткам разных типов — эпителиальным, нервным, костным, клеткам крови и другим, которые характеризуются разнообразием морфологии и макромолекулярного состава. Однако для клеток разных типов характерно и то, что они содержат одинаковые наборы генов, но являются высокоспециализированными, выполняя лишь одну или несколько специфических функций, т. е. одни гены «работают» в клетках, а другие неактивны. Например,
Рис. 27. Развитие монозиготных близнецов
только эритроциты специфичны в синтезе и хранении гемоглобина. Точно так лишь клетки эпидермиса синтезируют кератин. Поэтому давно возникли вопросы о генетической идентичности ядер соматических клеток и о контрольных механизмах развития оплодотворенных яйцеклеток как пререквизита в познании механизмов, лежащих в основе дифференцировки клеток. В дифференциации клеток имеют большое значение стволовые клетки (см. ниже). В экспериментах на мышах показано, что клетки одного типа способны к конверсии в клетки другого типа. В частности, показано, что дифференцирующиеся или дифференцированные клетки печени конвертируются в клетки поджелудочной железы.
Начиная с 50-х гг. XX в. во многих лабораториях были выполнены эксперименты по успешной пересадке ядер соматических клеток в яйцеклетки, искусственно лишенные собственных ядер. Исследование ДНК из ядер разных дифференцированных клеток показало, что почти во всех случаях геномы содержат одинаковые наборы последовательностей нуклеотидных пар. Известны исключения, когда эритроциты млекопитающих теряют свои ядра в течение последней стадии дифференцировки. Но к этому времени пулы стой-
ких гемоглобиновых мРНК уже синтезированы, так что ядра больше не нужны эритроцитам. Другими примерами служат гены иммуно- глобулинов и Т-клеток, модифицируемые в ходе развития.
Одним из крупных этапов в направлении познания контрольных механизмов эмбрионального онтогенеза стали результаты экспериментов, выполненных в 1960-1970 гг. английским исследователем Д. Гердоном с целью выяснить, обладают ли ядра соматических клеток способ- ностью обеспечивать дальнейшее развитие яйцеклеток, если эти ядра ввести в яйцеклетки, из которых предварительно удалены собственные ядра. На рис. 28 приведена схема одного из этих экспериментов, в котором ядра соматических клеток головастика пересаживали в яйцеклетки лягушки с предварительно удаленными ядрами. Эти эксперименты показали, что ядра соматических клеток действительно могут обеспечивать дальнейшее развитие яйцеклеток, так как они оказались способными оплодотворять яйцеклетки и «заставляли» их развиваться дальше. Этим была доказана возможность клонирования животных.
Рис. 28. Схема эксперимента по пересадке ядер соматических клеток в безъядерные яйцеклетки (Д. Гердон, 1968)
Позднее другими исследователями были выполнены эксперименты, в которых показано, что перенос отдельных бластомеров из 8- и 16-дневных эмбрионов овец одной породы в безъядерную половину яйцеклетки (после рассечения последней пополам) другой породы сопровождался формированием жизнеспособных эмбрионов с последующим рождением ягнят.
В начале 1997 г. английскими авторами было установлено, что введение в искусственно лишенные ядра яйцеклеток овец ядер соматических клеток (клеток эмбрионов, плодов или вымени взрослых овец), а затем имплантация оплодотворенных таким образом яйцеклеток в матку овец сопровождается возникновением беременности с последующим рождением ягнят (рис. 29). Один из ягнят был назван Долли. В 2003 г. Долли погибла. За это время были получены эмбрионы мышей, коров, кроликов, лошади, крысы и других животных.
Введение культуры в организм матери
Рис. 29. Пересадка ядер соматических клеток в безъядерные яйцеклетки
Оценка этих результатов показывает, что млекопитающих можно размножать асексуальным путем, получая потомство животных, клетки которых содержат ядерный материал отцовского или материнского происхождения в зависимости от пола овцы-донора. В таких клетках
лишь цитоплазма и митохондрии имеют материнское происхождение. Это заключение имеет чрезвычайно важное общебиологическое значение, расширяет наши взгляды на потенциал размножения животных. Но важно также добавить, что речь идет о генетических манипуляциях, которые в природе отсутствуют. С другой стороны, в практическом плане эти генетические манипуляции представляют собой прямой путь клонирования высокоорганизованных животных с заданными свойствами, что имеет важное экономическое значение. В медицинском плане этот путь, возможно, будет использован в будущем для преодоления мужского бесплодия.
Итак, генетическая информация, необходимая для нормального развития эмбриона, не теряется в течение дифференцировки клеток за счет так называемых стволовых клеток, которые обладают потенцией развиваться в различные типы клеток тела. Когда стволовые клетки делятся, каждая новая клетка имеет потенцию или оставаться стволовой клеткой, или стать клеткой с более специализированной функцией (мышечные клетки, клетки крови или клетки головного мозга). Оплодотворенная яйцеклетка является тотипотентной, так как дает начало разным типам клеток тела. Тотипотентные стволовые клетки могут дать начало любому типу клеток, кроме тех, которые необходимы для развития плода. Стволовые клетки, которые могут дать начало самым различным клеточным типам, обычно называют мультитотипотентными клетками. Установлено, что взрослые стволовые клетки могут продуцировать дифференцированные клетки из эмбриональных несвязанных тканей. Соматические клетки тоже обладают свойством, получившим название тотипотентности, т. е. в их геноме содержится вся информация, полученная ими от оплодотворенной яйцеклетки, давшей им начало в результате дифференциации. Наличие этих данных с несомненностью означает, что дифференциация клеток подвержена генетическому контролю. Изучение стволовых клеток имеет значение для медицины.
Установлено, что интенсивный белковый синтез, следующий за оплодотворением, у большинства эукариотов не сопровождается синтезом мРНК. Изучение овогенеза у позвоночных, в частности у амфибий, показало, что интенсивная транскрипция происходит еще в течение профазы I (особенно диплонемы) мейоза. Поэтому генные транскрипты в форме молекул мРНК или про-мРНК сохраняются в яйцеклетках в бездействующем состоянии. Установлено, что у эмбриональных клеток имеет место так называемое асимме-
тричное деление, заключающееся в том, что деление эмбриональной клетки дает начало двум клеткам, из которых лишь одна наследует белки, принимающие участие в транскрипции. Таким образом, неравное распределение транскрипционных факторов между дочерними клетками ведет к экспрессии в них разных наборов генов после деления, т. е. к дифференциации клеток.
У амфибий и, возможно, у большинства позвоночных генетические программы, контролирующие раннее развитие (до стадии бластулы), устанавливаются еще в течение овогенеза. Более поздние стадии развития, когда начинается клеточная дифференциация (примерно, со стадии гаструлы), нуждаются в новых программах для экспрессии генов. Таким образом, дифференцировка клеток связана с перепрограммированием генетической информации в том или ином направлении.
Характерная особенность дифференцировки клеток заключается в том, что она необратимо ведет к тому или иному типу клеток. Этот процесс носит название детерминации и также находится под генетическим контролем, а как сейчас предполагают, дифференциация и детерминация клеток регулируются взаимодействием клеток на основе сигналов, осуществляемых пептидными ростовыми факторами через тирозинкиназные рецепторы. Вероятно, существует много таких систем. Одна из них заключается в том, что дифференциация мышечных и нервных клеток регулируется нейрорегулина- ми, представляющими собой мембранные белки, действующие через один или более тирозинкиназный рецептор.
Генетический контроль детерминации демонстрируется также существованием так называемых гомейотропных или гомеозисных мутаций, которые, как показано у насекомых, вызывают изменения при детерминации в специфических имагинальных дисках. В результате некоторые части тела развиваются не на своих местах. Например, у дрозофил мутации трансформируют детерминацию антенного диска в диск, который развивается в аппендикс конечности, протянутой от головы. У насекомых из рода Ophthalmoptera структуры крыльев могут развиваться из диска для глаз. У мышей показано существование генного кластера (комплекса) Нох, который состоит из 38 генов и контролирует развитие конечностей.
Самостоятельное значение имеет вопрос о регуляции активности генов в период эмбрионального развития. Считают, что в ходе дифференцировки гены действуют в разное время, что выражается
в транскрипции в различных дифференцированных клетках разных мРНК, т. е. имеют место репрессия и дерепрессия генов. Например, количество генов, транскрибируемых в РНК в бластоцитах морского ежа, равно 10\%, в клетках печени крыс — тоже 10\%, а в клетках тимуса крупного рогатого скота — 15\%. Предполагают, что в контроле транскрипционного статуса генов принимают участие негистоновые белки. В пользу этого предположения свидетельствуют следующие данные. Когда хроматин клеток в фазе S транскрибируется в системе in vitro, то синтезируется только гистоновая мРНК, а в след за нею и гистоны. Напротив, когда используют хроматин клеток из (^-фазы, то никакой гистоновой мРНК не синтезируется. Когда же непистоновые белки удаляются из хроматина (1-фазы и замещаются негистоновыми хромосомными белками, синтезированными в фазе S, то после транскрипции такого хроматина in vitro синтезируется гистоновая мРНК. Более того, когда негистоновые белки происходят из (1-фазы клеток, а ДНК и гистоны — из S-фазы клеток, никакой гистоновой мРНК не синтезируется. Эти результаты показывают, что содержащиеся в хроматине негистоновые белки определяют возможность транскрипции генов, кодирующих гистоны. Поэтому считают, что негистоновые хромосомные белки могут играть важную роль в регуляции и экспрессии генов у эукариот.
Имеющиеся данные позволяют считать, что в регуляции транскрипции у животных принимают участие белковые и стероидные гормоны. Белковый (инсулин) и стероидные (эстрогон и тестостерон) гормоны представляют собой две сигнальные системы, используемые в межклеточных коммуникациях. У высших животных гормоны синтезируются в специализированных секреторных клетках. Освобождаясь в кровяное русло, они поступают в ткани. Поскольку молекулы белковых гормонов имеют относительно крупные размеры, то они не проникают в клетки, поэтому их эффекты обеспечиваются белками-рецепторами, локализованными в мембранах клеток-мишеней, и внутриклеточными уровнями циклического АМФ (цАМФ). Напротив, стероидные гормоны являются малыми молекулами, вследствие чего легко проникают в клетки через мембраны. Оказавшись внутри клеток, они связываются со специфическими рецепторными белками, которые имеются в цитоплазме только клеток-мишеней. Как считают, комплексы гормон — белковый рецептор, концентрируясь в ядрах клеток-мишеней, активируют транскрипцию специфических генов через взаимодействие с определенны-
ми негистоновыми белками, которые связываются с промоторными районами специфических генов. Следовательно, связывание ком- плекса гормон + белок (белковый рецептор) с негистоновыми белками освобождает промоторные районы для движения РНК-полимеразы. Обобщая данные о генетическом контроле эмбрионального периода в онтогенезе организмов, можно заключить, что его ход контролируется дифференциальным включением и выключением действия генов в разных клетках (тканях) путем их дерепрессии и репрессии.