Молекулярно-генетические методы применяются для работы с ДНК и РНК, с геном, определяют его структуру (секвенирование), т.е. последовательность азотистых оснований и изменения в ней (мута-
ции, динамические мутации) или последовательность аминокислот в белке, положение на хромосоме по отношению к другим генам и расстояние между ними (физическое картирование).
С помощью ДНК-анализа можно не только подтвердить диагноз заболевания при развернутой клинической картине, но определить заболевание пренатально, в доклинической стадии или выявить гетерозиготное носительство.
Исходным этапом всех молекулярно-генетических методов является получение образцов ДНК (РНК): геномной (из клеток) или определенных фрагментов, подлежащих анализу. Для получения геномной ДНК можно использовать любые ядросодержащие клетки, но чаще работают с лейкоцитами, фибробластами, клетками хориона, амниотической жидкости, при этом необходимо небольшое количество биологического материала, иногда достаточно пятна крови, соскоба со слизистой щеки, несколько волосяных луковиц. Для работы с геномной ДНК используется методика блот-гибридизации по Саузерну (от английского blot — промокать и по фамилии доктора, предложившего метод). Выделенная клеточная ДНК обрабатывается одной из рестрикционных эндонуклеаз (фермента, «разрезающего» ДНК в строго определенных сайтах). В результате получается характерный только для данного человека набор из огромного множества фрагментов различной длины, которые при электрофорезе (фракционирование в геле) располагаются в зависимости от их молекулярной массы. На следующем этапе происходит сам блоттинг: фрагмент ДНК переносится осмотическим током жидкости из влажного геля на помещенный на него фильтр, на котором «отпечатывается» ДНК-фрагмент после его фиксации. Для визуализации фрагмента применяют гибридизацию со специфическим по нуклеотидной последовательности меченым (радиоили флюоресцентной меткой) ДНК-зондом, предварительно переведя фрагмент в одноцепочечное состояние (денатурация). Именно зонд выявляет необходимый фрагмент, если он присутствует в исследуемом множестве рестриктов. После его визуализации можно судить о перестройках в последовательностях нуклеотидов исследуемого гена и в ближайших к нему участках.
В большинстве случаев достаточно исследовать небольшой фрагмент ДНК. Для проведения анализа необходимо получить достаточное количество исследуемых фрагментов, «размножить» их, т.е. амплифицировать. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) — метод
амплификации отдельных фрагментов ДНК in vitro, позволяющий за короткое время получить громадное (в миллион раз) увеличение числа копий за счет постоянно повторяющихся циклов синтеза все новых и новых копий исследуемого фрагмента ДНК в соответствии со структурой матрицы.
Различают прямую и косвенную ДНК-диагностику моногенных болезней.
Прямая ДНК-диагностика выявляет мутации в клонированном гене с известной нуклеотидной последовательностью. Главное преимущество этого метода — 100\% точность диагностики и ее возможность при обследовании только одного человека. Еще к одному достоинству можно отнести возможность диагностики гетерозиготного носительства мутантного гена у здоровых родителей умершего ребенка и его ближайших родственников, что особенно актуально при аутосомно-рецессивных заболеваниях.
К сожалению, прямая ДНК-диагностика применяется пока только для сравнительно небольшого числа наиболее распространенных моногенных болезней (муковисцидоз, фенилкетонурия, прогрессирующая мышечная дистрофия Дюшенна, нейрофиброматоз, синдром ломкой Х-хромосомы, недостаточность α1-трипсина , талассемии и некоторые другие).
К недостаткам метода можно отнести его неполную информативность из-за широкого спектра мутаций в одном и том же гене, обусловливающих развитие наследственного заболевания.
Непрямые (косвенные) методы ДНК-диагностики моногенных болезней более универсальны, так как могут применяться в тех случаях, когда ген болезни точно не идентифицирован, но известна его локализация на определенной хромосоме, ген протяженный, мутации в гене слишком разнообразны при отсутствии выраженных мажорных (главных) мутаций. ДНК-диагностика в этом случае строится на семейном анализе различных ДНК-полиморфных маркеров, находящихся в том же хромосомном регионе или тесно сцепленных с локусом заболевания. Ценность полиморфного маркера зависит также от генетического расстояния между маркером и повреждением в гене. Применение косвенных методов предусматривает также в качестве обязательного предварительного этапа исследование частоты аллелей соответствующих полиморфных сайтов в анализируемых популяциях, среди больных и гетерозиготных носителей мутаций, а также определение вероятности рекомбинации и неравновесия по
сцеплению между маркерными сайтами и мутантными аллелями гена. Основной недостаток косвенного метода — не 100\% точность. Типичные ошибки составляют 1-5\%. К недостаткам косвенной диагностики следует отнести необходимость семейного анализа и уверенность в клиническом диагнозе, который ни опровергнуть, ни подтвердить этим методом невозможно, а также использование только для монолокусных заболеваний. Совместное использование прямых и косвенных методов ДНК-диагностики позволяет получить наиболее точный результат.