СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ДНК-ДИАГНОСТИКИ

Методы идентификации мутаций генов наследственных болезней

К методам идентификации мутаций генов наследственных болезней относятся: идентификация известных мутаций, идентификация невыявленных мутаций, идентификация мутаций и генетических полиморфизмов.

Идентификация известных мутаций

В настоящее время идентифицированы сотни генов, мутации в которых вызывают моногенные и мультифакториальные заболевания. Созданы банки данных об этих генах, отражающие спектр, классификации и механизмы возникновения мутаций, а также методы их диагностики. Во многих генах выделены мажорные (наиболее часто встречающиеся) мутации, разработаны алгоритмы молекулярной диагностики.

Кроме того, созданы коммерческие наборы, выявляющие в автоматическом режиме сразу несколько диагностически значимых мутаций в генах разных заболеваний, например миодистрофии Дюшенна- Беккера, МВ, серповидно-клеточной анемии и ФКУ.

Из известных точковых мутаций наиболее просто диагностируются однонуклеотидные замены, которые приводят или к исчезнове-

нию, или к образованию сайта узнавания эндонуклеаз (рестриктаз) после обработки этими ферментами амплифицированного фрагмента ДНК, содержащего мутацию. Сайт узнавания (рестрикции) – это специфическая область ДНК размером в 5-6 нуклеотидов.

К методам выявления известных мутаций также относятся следующие.

Амплификации рефрактерной мутационной системы

Метод амплификации рефрактерной мутационной системы (ARMS) предложен C.R. Newton et al. и C.D.K. Bottema et al. в 1989-

1990 гг.

Суть метода состоит в параллельной постановке двух ПЦР, для одной из которых праймером служит аллельспецифическая мутантная ДНК, а другой – нормальные олигонуклеотидные последовательности ДНК. При этом в качестве второго праймера в двух реакциях выбирают одну и ту же олигонуклеотидную последовательность, чтобы могли амплифицироваться участки ДНК одинаковой протяженности.

В исследуемой ДНК амплифицированные фрагменты образуются только в том случае, если в качестве аллельспецифичного праймера выбирается мутантная последовательность, тогда как нормальный олигонуклеотидный праймер блокируется.

Метод нашел широкое применение при идентификации мутаций в генах МВ, бета-талассемии, ФКУ и для типирования генов HLA- системы.

При применении этого метода возможно полное автоматическое сканирование.

ПЦР-опосредованный сайт-направленный мутагенез

Метод ПЦР-опосредованного сайт-направленного мутагенеза предложен H.G. Eiken et al. и I.S.L. Ngo et al. в 1991 г.

Суть метода состоит в том, чтобы выбор амплифицируемого участка ДНК соответствовал следующим требованиям:

•  3′-конец одного из праймеров должен примыкать непосредственно к мутантному сайту;

•  один из нуклеотидов со стороны 3′-конца следует изменить так, чтобы он в сочетании с нуклеотидом мутантного сайта мог создать (или не создать) в этом месте сайт рестрикции для какойлибо нуклеазы.

Таким образом, обязательным условием является то, что ПЦРпродукты с нормального и мутантного аллелей должны отличаться

по наличию индуцированного сайта рестрикции. В результате на электрофореграмме у гомозигот будет присутствовать два фрагмента, содержащих мутацию, а у гетерозигот – один фрагмент, и все они должны соответствовать по длине рестрифицированным участкам молекулы ДНК.

К сожалению, из-за наличия этого обязательного условия данный метод почти не востребован в диагностике наследственных болезней. Аллельспецифические олигонуклеотиды

Метод аллельспецифических олигонуклеотидов (ASO) предложен J. Reiss в 1991 г. Суть метода состоит в амплификации фрагментов ДНК и последующей гибридизации с мечеными аллельспецифическими олигонуклеотидами, к которым обычно относятся последовательности размером 19 н.п., имеющие в центре мутантный сайт.

При этом каждый из двух зондов должен быть комплементарным к нормальному или мутантному вариантам ДНК. Условия гибридизации подбирают таким образом, чтобы стабильные дуплексы образовывались при полной комплементации гибридных пар. В таких условиях амплифицированные фрагменты ДНК без мутации будут гибридизироваться только с нормальным зондом, ДНК гомозигот с мутацией – только с мутантным зондом, а ДНК гетерозигот – с обоими маркерными зондами.

В 1994 г. И.В. Лебедева и соавторы предложили модифицированный вариант этого метода с использованием аллельспецифических ДНК-зондов, меченных биотином или пероксидазой хрена (метод применяется для автоматической регистрации мажорных мутаций при муковисцидозе и серповидноклеточной анемии).

В модификации F.F. Chebaba (1993) для автоматического анализа используется принцип ленточного фильтра (стрипта) с нанесенными пятнами олигопраймеров, каждый из которых соответствует определенной мутации. Стрипт помещают в раствор со смесью меченых амплифицированных фрагментов и создают условия для гибридизации, после чего выявляют тестируемые мутации. Именно этот принцип использован в ряде новых технологий исследования мутаций и генетических полиморфизмов (см. ниже).

Лигирование синтетических однонуклеотидных зондов

Метод лигирования синтетических однонуклеотидных зондов (OLA) был предложен U.N. Landergren в 1993 г. Суть метода состоит в том, что ДНК-зонды для лигирования подбирают так, чтобы они были полностью комплементарными нормальному фрагменту ДНК

в области локализации мутации, причем сама нуклеотидная замена должна находиться на стыке двух праймеров.

После гибридизации синтезированные нуклеотидные фрагменты сшиваются ДНК-лигазами, выделенными из термофильных микроорганизмов. В результате при наличии мутаций в анализируемом участке ДНК на конце одного из зондов образуется сайт некомплементарного спаривания, непосредственно примыкающий к месту лигирования. Сшивки между зондами в этом случае не происходят.

Метод включает несколько циклов гибридизации, лигирования и денатурации с последующим электрофоретическим анализом меченых однонитевых фрагментов ДНК. Метод был успешно применен для тестирования глобиновых генов при серповидноклеточной анемии и мутации F508 при МВ.

Идентификация невыявленных мутаций

Как оказалось, с помощью ПЦР выявляются не только протяженные делеции амплифицированных фрагментов ДНК, но и небольшие делеции и вставки единичных нуклеотидов, которые влияют на размеры этих фрагментов. Например, такие изменения можно зарегистрировать при электрофорезе в агарозном или полиакриламидном гелях при исследовании наиболее часто встречающихся мутаций в гене МВ (делеции трех нуклеотидов или del F508).

Вместе с тем, при замене одного или нескольких нуклеотидов в гене длина амплифицированного фрагмента остается неизменной, тогда как некоторые физико-химические свойства мутантной молекулы меняются. Разработаны разные варианты поиска мутантных фрагментов ДНК и идентификации в них точковых мутаций. Основными из них являются следующие методы.

Анализ конформационного полиморфизма однонитевой ДНК или выявление точковых мутаций

Метод анализа конформационного полиморфизма однонитевой ДНК или выявления точковых мутаций (метод SSCP), предложен М. Orita et al. (1989) и D. Clavac, M. Dean (1993). Метод получил широкое распространение. Метод включает амплификацию фрагментов размером от 50 до 300 н.п., их денатурацию и электрофорез в полиакриламидном геле. Эффективность обнаружения (детекции) мутаций при размерах фрагмента менее 200 н.п. составляет 70-95\%, а при длине более 400 н.п. уменьшается до 50\%. Метод основан на регистрации различий в электрофоретической подвижности одно-

нитевых фрагментов молекулы ДНК (одинаковых по величине, но разных по пространственной ориентации) вследствие имеющихся в них разных нуклеотидных замен, что влияет на конформацию (скручивание) небольших однонитевых фрагментов.

Денатурирующий градиентный гель-электрофорез

Метод денатурирующего градиентного гель-электрофореза (DGCE) был предложен Р. Майерс и др. (1990), а также R. Fodde и М. Losekoot (1994). Метод основан на зависимости свойств денатурации небольших двухнитевых молекул ДНК от их нуклеотидной последовательности (соотношение АТ-пар и ГЦ-пар).

Различия выявляются при сравнении подвижности нормальных и мутантных двухнитевых фрагментов ДНК при их электрофорезе в условиях денатурации благодаря разности температур при создании градиента концентрации мочевины или формальдегида в геле.

Метод пригоден для анализа крупных фрагментов ДНК. Его разрешающая способность при исследовании фрагментов до 600 н.п. составляет 95\%.

Метод эффективно применяется при анализе индуцированных точковых мутаций, возникающих в одной из 100 клеток, обработанных мутагеном. Однако он технически сложен и отличается высокой стоимостью.

Гетеродуплексный анализ

Метод гетеродуплексного анализа (НА) предложен W. Hiao и P.J. Oefner в 2001 г. Позволяет идентифицировать мутации, локализованные в одной из нитей матричной ДНК и находящиеся в гетерозиготном состоянии. В амплифицированной смеси наряду с двумя типами гомодуплексов (нормальная и мутантная последовательности нуклеотидов) возникают гетеродуплексы между нормальной и мутантной цепочками ДНК.

У мутантных гетеродуплексов иная подвижность, чем у гомодуплексов (за счет конформационных особенностей в местах несовпадения нуклеотидов – mismatch), что выявляется при электрофорезе в полиакриламидном геле.

Разрешающая способность метода при исследовании фрагментов менее 300 н.п. достигает 80-95\%.

Имеются модифицированные варианты этого метода, например, дополненные конформационно-чувствительным гель-элекрофорезом в сочетании с флуоресцентными красителями – метод CSGE (широко используется для поиска мутаций в разных генах); метод жидкостной хроматографии – метод DNPLC (см. ниже).

Химическое расщепление некомплементарных сайтов

Метод химического расщепления некомплементарных сайтов или метод СМС, предложен М. Grompe в 1993 г. Информативность – 95-100\%. Метод основан на способности ряда химических соединений или ферментов специфически разрывать нить ДНК в месте локализации неспаренного основания (рис. 62).

В частности, высокой чувствительностью к гидроксиламину отличается неспаренный цитозин, а к тетраоксиду осмия – неспаренный тимин. Последующая обработка такой молекулы ДНК пиперидином ведет к ее полному разрыву в модифицированном сайте.

Суть метода СМС заключается в выявлении мутаций с помощью меченых ДНК-зондов, соответствующих нормальным вариантам молекулы ДНК. Такими зондами служат синтезированные олигонуклеотиды, клонированные участки ДНК или амплифицированные фрагменты. При применении метода эталонную меченую ДНК смешивают с избытком тестируемой ДНК или РНК. К тестируемым образцам ДНК относятся клонированные ДНК, обработанные соответствующими эндонуклеазами, либо амплифицированные фрагменты. Смесь нагревают до полной денатурации двухнитевых молекул и после этого охлаждают, чтобы создать условия для образования дуплексов.

При наличии мутаций в тестируемых образцах ДНК (в гетеродуплексах, возникших в результате гибридизации между однонитевыми молекулами эталонной и тестируемой ДНК) образуются места негомологичного спаривания.

После обработки соответствующими химическими агентами на основе электрофореза и радиоавтографии проводится идентификация и локализация мутантных сайтов в исследуемых участках ДНК. Появление укороченных фрагментов ДНК на электрофореграмме указывает на наличие мутантного сайта, а определение размера укороченного фрагмента выявляет локализацию этого сайта в тестируемой молекуле ДНК.

Большими преимуществами метода СМС являются:

•  возможность исследовать протяженные участки ДНК (до 2 тыс. н.п.);

•  возможность одновременно выявлять (локализовать) несколько мутаций в одном фрагменте ДНК;

•  возможность использовать несколько ДНК-зондов для поиска мутаций (при мультиплексном варианте метода).

В последние годы для идентификации точковых нуклеотидных замен широкое применение получил флуоресцентный вариант этого метода.

Идентификация мутаций и генетических полиморфизмов

Денатурирующая жидкостная хроматография высокого разрешения

Метод денатурирующей жидкостной хроматографии высокого разрешения (DNPLC) был предложен P.J. Oefner и P.A. Underbill в 1995 г. Позволяет в течение 2-3 мин определить однонуклеотидные замены, делеции и инсерции в амплифицированных участках с размерами до 1,5 тыс. н.п. Информативность метода достигает 95\%. Метод представляет собой модифицированный вариант гетеродуплексного

Рис. 62. Принцип метода СМС (по Баранову В.С., Иващенко Т.Э., 2005)

анализа с последующим автоматическим анализом результатов при помощи жидкостной хроматографии (см. выше).

Согласно этому методу, продукты ПЦР исследуемого фрагмента ДНК подвергаются частичной денатурации в растворе с контрольными образцами того же фермента в соотношении 1:1 путем нагревания смеси до 95 °С и медленной последующей ренатурации (охлаждение).

При отсутствии мутаций в исследуемом фрагменте формируется только один тип гомодуплексов, тогда как при наличии мутаций – несколько типов гетеродуплексов и гомодуплексов.

Возникающие гетеродуплексы значительно менее устойчивы к температуре, чем гомодуплексы. Именно это свойство улавливается с помощью жидкостной хроматографии.

Предварительный подбор температур плавления гомо- и гетеродуплексов резко повышает чувствительность данного метода по сравнению с таковой SSCP-метода (см. выше), метода двухмерного сканирования гена и собственно гетеродуплексного анализа (см. выше).

Метод DNPLC широко используется при генотипировании путем определения однонуклеотидных замен (SNP) и EST (Hiao W. и Oefner P.J., 2001), а также при первичном анализе мутаций в генах-кандидатах, изучении молекулярных маркеров и мутаций Y-хромосомы и вообще при картировании генов.

Поверхностный плазмоновый резонанс

Метод поверхностного плазмонового резонанса (метод SPR) основан на одноименном явлении, представляющем квантово-оптический (оптико-электронный) феномен, возникающий в результате взаимодействия между поляризованным светом с определенной длиной волны и поверхностью металла.

Метод SPR позволяет выявлять молекулы ДНК и контролировать процесс связывания между двумя молекулами и более в режиме реального времени. Взаимодействие фрагментов ДНК приводит к изменению показателя преломления света в поверхностном слое чувствительного датчика, которое фиксируется как изменение в интенсивности сигнала SPR. При этом одна из взаимодействующих молекул в реальном времени отражается на сенсорограмме.

Уже при введении образца проба связывается с иммобилизованными на поверхности чувствительного датчика олигонуклеотидами, что усиливает сигнал SPR. В конце процедуры введения

образца проба изменяется под непрерывной струей буфера, и наблюдающееся уменьшение сигнала SPR отражает диссоциацию пробы от поверхностно-связанного комплекса. В зависимости от нуклеотидного состава исследуемой молекулы ДНК характер ассоциации и диссоциации изменяется (рис. 63). ДНК-чипы

С помощью метода ДНК-чипов достигнуты значительные успехи в идентификации и массовом сканировании однонуклеотидных замен (SNP).

• Чипы (arrays) – это серии коротких олигонуклеотидных последовательностей, отличающихся по своему составу и зафиксированных (химическими способами) на стекле таким образом, что на 1 см2 их размещается до 1000. При этом позиция каждого чипа четко фиксируется и может определяться в автоматическом режиме. В настоящее время применяются 3 типа чипов. Гибридизационные чипы. Они разработаны на основе аллельспецифической гибридизации. Это олигонуклеотидные последова-

Рис. 63. Схема сенсорограммы (по Баранову В.С., Иващенко Т.Э., 2005)

тельности, комплементарные двум разным аллелям (SNP), фиксируются на стекле. Флуоресцентный ПЦР-продукт, содержащий SNP, гибридизируется на чипе, и образовавшийся гибридизационный паттерн анализируется под микроскопом или с помощью специальных компьютерных программ.

•  Чипы с фиксацией олигонуклеотидов на агарозной матрице. Они разработаны на основе аллельспецифической гибридизации, но фиксируются при помощи электрического тока на специальной агарозной подложке или матрице. Взаимодействие анализируемых проб с олигонуклеотидными последовательностями происходит под действием электрического поля, которое направляет отрицательно заряженные фрагменты ДНК к положительно заряженному чипу с иммобилизованными на нем последовательностями. При этом концентрация последовательностей в анализируемой пробе локально повышается в непосредственной близости от чипа, что позволяет повысить скорость гибридизации и сократить время проведения анализа.

•  Чипы с ферментным процессингом. Они разработаны на основе двух методов: блот-гибридизации и ПЦР. Суть разработки: олигонуклеотиды, примыкающие к SNP, фиксируются на чипе, затем проводится реакция с ДНК-полимеразой и дидезоксинуклеотидами, меченными разными флуорохромами. В этой реакции каждый зафиксированный на матрице олигонуклеотид становится праймером для ПЦР, которая начинается и заканчивается присоединением к праймеру единственного меченого дидезоксинуклеотида, соответствующего нуклеотиду на матрице. Цвет флуоресценции свидетельствует о том, какой из четырех нуклеотидов вступил в реакцию с олигопраймером.

Таким образом, ДНК-чипы позволяют не только быстро идентифицировать SNP, но и определять их природу (Gut I.G., 2001 г.).

Анализ сцепления болезни с полиморфными маркерами

Анализ сцепления болезни с полиморфными маркерами считается одним из наиболее перспективных методов диагностики. Метод предложен американским генетиком Д. Ботстейном в 1980 г. Используется для определения локусов, сцепленных с моногенными и мультифакториальными заболеваниями в семьях (включая злокачественные опухоли).

Как известно (см. главу 5), на хромосомной карте человека локализовано около 6 тыс. полиморфных генных локусов или полиморфных

ДНК-маркеров. Для анализа обычно используются 300-500 маркеров, распределенных по всему геному, т.е. это метод полногеномного сиквенирования.

По существу, данный метод обеспечивает картирование локуса, сцепленного с заболеванием, и последующий скрининг на мутации в генах-кандидатах, лежащих внутри картированной области или области позиционных кандидатов.

Именно эта стратегия получила название стратегии позиционного клонирования или «обратной генетики» (путь от гена к признаку, см. главу 1).

Анализ полиморфизма длин рестрикционных фрагментов

Метод анализа полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ) позволяет маркировать нормальные и патологические гены в ядерных семьях и определять их наличие у членов семейной родословной, что имеет большое значение для профилактики наследственной патологии. Наиболее просто идентифицируются мутации, изменяющие длину амплифицированных фрагментов, ибо они легко визуализируются при электрофоретическом анализе.

В частности, протяженные делеции захватывают целые экзоны и могут быть выявлены по изменению длины рестрикционных фрагментов методом блот-гибридизации.

Для выявления протяженных делеций на половых хромосомах разработан простой и надежный вариант диагностики – мультиплексная ПЦР, например, для обнаружения делеций в гене дистрофина при миодистрофии Дюшенна-Беккера.

Другой вариант ПЦР, позволяющий идентифицировать протяженные делеции у гетерозигот, основан на использовании в качестве матрицы для ПЦР кодирующей ДНК (кДНК), полученной путем обратной транскрипции мРНК, изолированной из тканей или культур клеток, экспрессирующих ген дистрофина.

Особое значение метод анализа ПДРФ имеет для пренатальной диагностики наследственных болезней. Например, в случае обнаружения у плода гена миодистрофии Дюшенна-Беккера или гена ФКУ такая беременность должна быть прервана.

Анализ полиморфизма микросателлитных последовательностей

Как сказано выше, микросателлитные повторы – это наиболее удобный объект для применения косвенной ДНК-диагностики. Показано, что кластеры динуклеотидных СА-повторов встречаются в геноме человека с частотой 1 кластер в среднем на 30 тыс. н.п. Причем

во многих кластерах присутствуют от 10 до 30 динуклеотидных пар, и типичное количество аллелей составляет 4-8, что обеспечивает высокую информативность метода анализа полиморфизма микросателлитных последовательностей (повторов) и позволяет определить, с каким из этих повторяющихся аллелей в ядерной семье сцеплено повреждение ДНК и на каком расстоянии от маркера оно находится – все это имеет большое значение для оценки генетического риска, который определяется частотой рекомбинации между сайтом повреждения и полиморфным генным локусом.

Анализ ассоциации болезни с полиморфными маркерами

Метод анализа ассоциации болезни с полиморфными маркерами основан на сравнении частот встречаемости конкретных полиморфных маркеров у больных с МФЗ и здоровых лиц в одной популяционной группе.

Полиморфными маркерами служат определенные аллели генов и антигены HLA-комплекса. Наиболее частые ассоциации с HLA- антигенами разных классов выявлены при аутоиммунных и инфекционных заболеваниях. Достоверными являются ассоциации с HLA- антигенами при анкилозирующем спондилите (антиген В27), болезни Аддисона (DR3), гемохроматозе (A3), гнездной алопеции (DQW7), псориазе CW6), псориатическом спондилите (В27), рассеяном склерозе (DR3), ревматоидном артрите (DR4).

Наибольшая эффективность метода отмечается при применении в популяциях с высоким уровнем инбридинга, а также в ядерных семьях с разными типами браков.

Анализ идентичных по происхождению аллелей

Метод анализа идентичных по происхождению аллелей или метод IBD, относится к непараметрическим методам, основанным на изучении частоты встречаемости одного и того же аллеля в разных парах родственников (сибсы, дядя-племянник, дед-внук), ибо известно, что среди родственников общие аллели обнаруживаются чаще, чем при их случайной сегрегации. Если идентичный по происхождению аллель сцеплен с МФЗ, то частота его встречаемости в парах больных родственников будет достоверно превышать ожидаемую частоту при отсутствии сцепления, и в этом случае достоверность отличий будет оцениваться с помощью метода кси-квадрат.

FISH-метод диагностики хромосомных нарушений

Основным методом диагностики хромосомных болезней и хромосомных нарушений является цитогенетический метод.

В 90-е годы XX в. для диагностики хромосомной патологии был предложен молекулярно-цитогенетический метод FISH или метод флуоресцентной in situ гибридизации.

Данный метод имеет ряд преимуществ в сравнении с методом блот-гибридизации, сочетающейся с радиоактивным мечением. В частности, FISH-метод обеспечивает: более точную локализацию гибридизационного сигнала на хромосоме, проведение анализа за 2-3 дня, безопасность нерадиоактивной метки, одновременное использование не одного, а нескольких ДНК-зондов с различной цветовой окраской.

Вместе с тем, для эффективного применения FISH-метода, например для идентификации хромосом, фрагментов онкогенов, фрагментов гена инсулина и других компонентов хромосом, необходимо наличие коллекции меченных биотином ДНК-зондов, а также дорогостоящей флуоресцентной микроскопической техники.

Методы диагностики врожденных аномалий развития

Молекулярно-генетическая диагностика врожденных аномалий развития направлена на определение их первопричины. Среди генетических причин врожденных аномалий развития могут быть мутации доминантно и рецессивно наследуемых генов, аддитивное действие генов и факторов внешней среды и хромосомный дисбаланс (см. главу 23). Поэтому для идентификации таких причин применяется большой арсенал вышеперечисленных методов диагностики.

Тестирование неполноценного белка

Основными объектами для тестирования неполноценного белка служат продукты мутантных генов: неполноценные структурные или функциональные пептиды и полипептиды. Сначала из лейкоцитов крови выделяют тотальную мРНК, проводят обратную транскрипцию, амплифицируют специфические экзоны кДНК (метод RT-PCR). Затем встраивают амплифицированную область в экспрессионную бесклеточную систему и анализируют образовавшийся в ней белковый продукт.

Метод RT-PCR особенно эффективен при выявлении мутаций в протяженных генах, например при миодистрофии Дюшенна и нейрофиброматозе типа I.

Рейтинг
( Пока оценок нет )
Понравилась статья? Поделиться с друзьями:
yamedik
Добавить комментарий
Adblock
detector