Феномен экспансии нуклеотидных повторов имеет ряд характерных особенностей.
Универсальные характеристики
1. Кодирующие и некодирующие нуклеотидные повторы обнаруживаются в генах нормальных индивидов, они полиморфны по числу содержащихся в них копий повторов, что объясняет приобретение токсических функций молекулами агрегатов моноаминокислотных трактов, сформировавшихся в ходе экспансии.
2. Нуклеотидные повторы располагаются в разных областях генов, в том числе в промоторной области (гены FMR1 и FMR2), транскрибируемой, но нетранслируемой части гена (ген DMPK), экзонах (гены нейродегенеративных заболеваний) и интронах (ген FRDA);
3. Отмечается наличие порога предрасположенности к экспансии, после которого начинается генетическая и фенотипическая нестабильность (до порога — норма или состояние премутации, после порога — полная или динамическая мутация).
4. В случае превышения порога предрасположенности к экспансии наблюдается (одномоментное, скачкообразное) появление дополнительных копий повтора.
5. Не все нуклеотидные повторы предрасположены к нестабильности, которая зависит от нуклеотидного состава повторов, состояния кариотипа (хромосомного окружения) и биохимического статуса клетки. Зависимость стабильности повторов от их нуклеотидного состава связана со способностью повторов к образованию вторичных структур (повторы типа CNGn, где n — число повторов), которые образуют «несовершенные шпильки», стабилизированные взаимодействием как канонических пар оснований (АТ- и ГЦ-пары), так и неканонических пар оснований (другие сочетания двух азотистых оснований).
Если шпильки не образуются, то предрасположенность к экспансии резко снижается. По-видимому, здесь играет роль некий энергетический барьер, необходимый для образования шпилек. Вероятно, что этот энергетический барьер тесно связан с функцией тканевого (митохондриального) дыхания (см. главу 26).
В связи с такой характеристикой феномена экспансии был сделан вывод, что стабильность структур, образованных разными повторами, хотя и различается, но соответствует определенной шкале. В случае повтора CGG такая шкала выглядит как уравнение:
CGG > CCG = CTG > CAG
В этом уравнении первый повтор обладает наибольшим потенциалом для образования шпилек и демонстрирует наименьший для
всех известных тринуклеотидных повторов уровень репликативного скольжения (см. ниже).
6. Последовательность из 5 идентичных аминокислотных остатков и более определяется как полиаминокислотный тракт или белок длиной 400 аминокислот.
В протеоме человека содержатся 20\% белков, в составе которых обнаруживается по крайней мере один полиаминокислотный тракт. В таких трактах-повторах почти не встречаются аминокислоты аргинин, валин, изолейцин, метионин, тирозин, фенилаланин и цистеин. В то же время лейцин встречается в 19\% белков с одним полиаминокислотным трактом. При этом исключительным правилом для человека является вхождение полилейциновых повторов в сигнальные пептиды (см. главу 8).
7. Процесс экспансии копий нуклеотидных повторов связан с нарушениями систем репарации ДНК. Однако механизмы, приводящие к нестабильности повторов, и в том и в другом случае различаются.
8. Экспансия копий кодирующих и некодирующих нуклеотидных повторов сопровождается феноменом антиципации — это увеличение тяжести течения болезни по мере роста числа копий повторов. Одновременно наблюдается прямая корреляция между ростом числа копий повторов и временем манифестации заболевания.
Уникальные характеристики
1. Наличие одинаковых нуклеотидных повторов при разных нозологиях, проявляющихся разными патологическими фенотипами, обусловлено мутациями в разных генах.
Всего 9 болезней экспансии кодирующих повторов связаны с полиглутаминовыми трактами, образовавшимися в результате экспансии повтора CAG (кодирует глутамин в транслируемых областях генов). Включение таких трактов в структуру белков обусловливает их неправильное функционирование в ходе ДНК-белковых и белокбелковых взаимодействий и развитие патологических фенотипов.
Две болезни полиглутаминовых трактов обусловлены экспансией копий повтора СGG (гены FraXA и FraXE).
В свою очередь, из 9 болезней экспансии, связанных с образованием полиаланиновых трактов, четыре заболевания обусловлены полиморфизмом длин повторов GСА и GCT (гены: РАВРМ, RUNX2, ZIC2 и HOXA13). В редких случаях такие полиморфизмы связаны с дупликациями или делециями целых блоков смешанных повторов (GСN)n.
2. Кодирующие и некодирующие нуклеотидные повторы в случае болезней экспансии наследуются, как правило, по доминантному типу. Чтобы вызвать патологический фенотип, достаточно мутации в одном аллеле гена. Исключением из этого правила является прогрессирующая миоклонус-эпилепсия, обусловленная некодирующим повтором и наследуемая по рецессивному типу (см. MERRF-синдром в главе 26).
3. При болезнях экспансии, обусловленных кодирующими повторами ДНК, их копии в ряде случаев являются функционально полноценными кодонами генетического кода. Вместе с тем, они могут кодировать аминокислоты, из которых могут быть сформированы моноаминокислотные тракты. При этом изменение числа копий таких кодонов не ведет к сдвигу рамки считывания в ходе транскрипции.
4. Мутантные аллели при отдельных болезнях экспансии сцеплены с ломкими сайтами хромосом, называемыми маркерными сайтами, например, при синдроме Мартина-Белл — это сайты FraXF, Fra16A, Fra16B и Fra11. Такая особенность свидетельствует в пользу «эффекта родоначальника» при возникновении и сохранении мутаций в популяции.
5. По мере роста числа повторов мутантные аллели проявляют митотическую и мейотическую нестабильность.
6. Митотическая нестабильность проявляется тканевым (соматическим) мозаицизмом. Она обусловлена мутантными аллелями с разным числом копий повторов, проявляющими свое действие в одной или сразу нескольких тканях, например, при миотонической дистрофии и синдромах FraXA и FraXE. В частности, в первом случае соматический мозаицизм обнаружен у 13-16-недельных плодов, что выразилось у них в разной длине повторов, сохранявшейся в течение всей жизни.
7. Мейотическая нестабильность зависит от пути передачи мутантного аллеля по отцовской или материнской линии. В первом случае она проявляется быстрее (например, при нейродегенеративных заболеваниях), чем во втором случае (например, при миотонической дистрофии).
Молекулярные механизмы и модели экспансии
В последние годы предложен ряд моделей, характеризующих молекулярные механизмы феномена экспансии: репликативная, комбинативная и рекомбинационная модели.
Репликативная модель
Репликативная модель приведена на рис. 73.
Эта модель основана на модели репликации ДНК с участием фрагментов Оказаки (см. главу 2). Она свидетельствует, что динамическая мутация может быть результатом нарушения функционирования ДНК-полимеразы во время репликации, предшествующей митозу и мейозу. Фрагменты Оказаки имеют среднюю длину 150-200 н.п. Они участвуют в синтезе отстающей (запаздывающей) цепи ДНК, тогда как на основной (лидирующей) цепи синтез идет непрерывно. В данном случае при наличии на З’-конце протяженной монотонной последовательности будет наблюдаться скольжение вновь синтезированной нити относительно матричной нити ДНК.
Рис. 73. Модель экспансии повторов на запаздывающей цепи ДНК (по Eichler Е.Е. et al., 1994)
При этом возможны 2 варианта: либо часть фрагмента Оказаки (например, только З’-конец), либо весь фрагмент целиком находятся в пределах повтора. Первый вариант: 5′-конец фрагмента Оказаки фиксирован уникальной последовательностью ДНК или AGG-вставками, другой З’-конец фрагмента Оказаки свободно скользит вдоль комплементарной цепи, образуя вторичные структуры.
Второй вариант: совершенный или «чистый» повтор длиной 70 триплетов не фиксирован по своим краям уникальными последовательностями и также свободно скользит вдоль комплементарной цепи, образуя шпильки.
Высказано предположение, что при обоих вариантах уменьшенный уровень репликативного скольжения лежит в основе мутационного процесса при экспансии числа копий повторов.
Таким образом, репликативная модель экспансии у человека предполагает, что динамическая мутация может быть результатом нарушения функционирования ДНК-полимеразы во время репликации, предшествующей митозу и мейозу.
Комбинативная модель
Изменение длин тандемных повторов может быть результатом неравного кроссинговера (см. главу 5). Однако такая экспансия, во-первых, не сопровождается обменом фланкирующих последовательностей ДНК и, во-вторых, нельзя исключить неравный кроссинговер между сестринскими хроматидами, при котором в одинаковой степени может произойти как экспансия, так и сокращение длин повторов, что экспериментально не подтверждено.
Рекомбинационная модель
Наиболее обоснованной считается модель экспансии в результате рекомбинации или генной конверсии (см. главу 5).
Генная конверсия — это нереципрокный обмен между сестринскими хроматидами одной хромосомы или отклонение фактического обмена от ожидаемого теоретического обмена. Она может быть вызвана двухнитевыми разрывами вблизи нуклеотидных повторов
ДНК.
Не исключено, что генная конверсия может индуцироваться аномальной репликацией повторов и сопровождаться кроссинговером. В результате генной конверсии образуются как удлиненные, так и укороченные повторы.
Однако в отличие от неравного кроссинговера при генной конверсии это равновесие сдвигается в сторону преобладания нуклеотидных последовательностей с экспансией повторов.
На рис. 74 приведены модели генной конверсии, вызванной двухнитевыми разрывами ДНК.
Проблемы и пути определения механизмов патогенеза экспансии
В решении проблем патогенеза экспансии копий нуклеотидных повторов нет полной ясности. Экспансия реально существует при наличии в клетках стабильных систем репарации ДНК. Поэтому речь может идти о несостоятельности локальной репарации ДНК, зависящей от различий в генетическом и биохимическом микроокружении нуклеотидных повторов. В пользу такого предположения свидетельствуют две сходные по клинике, но разные по этиологии нозологии: одна — это прогрессирующая миоклонус-эпилепсия (если считать, что нет дефектов репарации), а другая — это митохондриальная миоклонус-эпилепсии с РКМВ, сопровождающаяся дефектами репарации или MERRF-синдром.
В пользу перспективности этого пути указывают данные о том, что все 27 нозологий болезней экспансии относятся к МБ человека. Как известно, в последние годы были показаны ранее неизвестные механизмы патогенеза многих МБ (см. главы 26, 28 и 29).