В таблице 18 приведены 9 БЭ некодирующих (микросателлитных) повторов.
Таблица 18. Характеристика болезней экспансии некодирующих (микросателлитных) повторов
Примечание. Знак «-» обозначает отсутствие данных.
Все указанные в этой таблице болезни обусловлены значительным увеличением размеров микросателлитных повторов. Они, как большинство БЭ кодирующих повторов, сопровождаются дегенерацией и дисфункцией разных тканей и органов и выраженностью
клинических проявлений. При этом, несмотря на ряд общих свойств, некодирующие микросателлитные повторы различаются по нуклеотидному составу и расположению относительно кодирующих и регуляторных элементов генома, что обусловливает упомянутую выше уникальность патогенетических механизмов при каждом конкретном заболевании.
В последние годы было показано, что некодирующие микросателлитные повторы, как правило, происходят из небольшого пула повторов промежуточных размеров.
Атаксия Фридрейха
Атаксия Фридрейха — это редкая БЭ, наследуемая по аутосомнорецессивному типу, при которой нет феномена антиципации. Клиника: атаксия, дизартрия, снижение рефлексов, кардиомиопатия, сахарный диабет. Морфологически выявляется дегенерация нейронов спинного мозга, ганглиев дорсальных корешков и сенсорных ганглиев. Причина — экспансия повтора GAA (мутация в гене фратаксина), ведущая к снижению его экспрессии и появлению протяженного повтора, богатого АТ-парами, затрудняющими транскрипцию. В результате в митохондриях накапливаются ионы железа, истощается мтДНК (феномен деплеции), угнетаются клеточное дыхание и работа железосерозависимых ферментов, что вызывает повышенную чувствительность к окислительному стрессу (см. главу 26).
Миотоническая дистрофия
Миотоническая дистрофия, тип 1
МД, тип 1 — это аутосомно-доминантное заболевание с мультисистемными проявлениями: катаракта, миотония, мышечная дистрофия, нарушение проводимости миокарда, эндокринные расстройства. При врожденной форме МД 1 наблюдаются множественные ВПР, гипотония, респираторный дистресс-синдром и УО.
Болезнь обусловлена мутациями в гене, локализованном в 19q13, и развивается в результате экспансии копий повтора CTG, который может одновременно присутствовать в 3′-нетранслируемой области гена протеинкиназы DMPK и промоторной области гена на хромосоме 19. Экспансия повтора CTG воздействует на уровень фермента DMPK, нарушая транскрипцию гена, процессинг и трансляцию
мРНК.
Внутри ядра накапливается мРНК с протяженным повтором CUS; она не попадает в цитоплазму, и поэтому изменяется внутриклеточ-
ная концентрация фермента DMPK, что ведет к аномальному фосфорилированию субстрата для этого фермента.
В последние годы выделены два гена, фланкирущих ген DMPK. Предполагается, что экспансия повтора CTG влияет на структуру хроматина и изменяет экспрессию близлежащих двух генов: гена DMAHP (в пределах его промоторной области расположен повтор CTG) и гена DMWD (расположен проксимально от гена DMPK, но вблизи от него). Полагают, что изменение функционирования этих двух генов может быть причиной МД 1.
Еще один механизм — это приобретение новой функции первичным транскриптом, имеющим протяженный тракт CUS (см. выше), т.е. возможен трансдоминантный эффект, нарушающий процессинг разных типов РНК, что обусловливает блокирование РНКсвязывающих белков CUS-ВР и разнообразие симптоматики.
В целом, можно выделить единый механизм МД 1 — это воздействие экспансии копий повтора CTG на свойства мРНК, кодируемой геном DMPK, и на экспрессию генов, расположенных вблизи этого повтора.
Миотоническая дистрофия, тип 2
МД, тип 2 — это гетерогенная болезнь, обусловленная тетрануклеотидным повтором CCTG, который расположен в транскрибируемой, но не транслируемой области гена ZNF9. Этот повтор в норме содержит 26 нуклеотидов; при МД 2 его размеры составляют от 75 до 11 000 (среднее значение около 5000) нуклеотидов.
Экспансия указанного повтора вызывает (независимо от хромосомного окружения и функционирования генов в клетке) выраженные мультисистемные расстройства, т.е. она крайне патогенна. При этом нет никакой функциональной гомологии между белком ZNF9 и протеинкиназой DMPK. По-видимому, в случае МД 2 основной причиной служит способность молекул с экспансией повторов CCTG создавать вторичные структуры в виде двухнитевой РНК, препятствующей нормальному ферментному расщеплению молекул, их созреванию и выходу в цитоплазму, что обусловливает накопление РНК с экспансией и мультисистемные расстройства.
Прогрессирующая миоклонус-эпилепсия
Прогрессирующая миоклонус-эпилепсия — это аутосомнорецессивное заболевание с хроническим течением и сочетанием миоклонических гиперкинезов с эпилептическими приступами, что ведет к церебеллярной атаксии.
Большинство мутаций — это крупные двенадцатинуклеотидные повторы (C)4G(C)4GCG или CCCCGCCCCGCG, расположенные в промоторной области гена CSTB. Причина болезни — мутация в гене цистатина В (CSTB), кодирующем фермент — ингибитор цистеиновых протеаз, что ведет к нарушению пространственной организации промоторных элементов и гиперметилированию. При этом экспансия увеличивает расстояние от сайта связывания активатора транскрипции до точки ее инициации, ограничивая пространственное взаимодействие активатора с другими элементами транскрипционного комплекса.
Как следствие этих событий, происходит избыточное связывание рецепторов транскрипции, нарушение синтеза соответствующих мРНК и белка, изменяется структура хроматина.
Ген болезни CSTB не локализован; он кодирует одноименный белок.
Болезнь проявляется при количестве повторов, (С)4G(С)4 GСG, равном 30-75 копиям.
Синдром Мартина-Белл
Синдром Мартина-Белл (СМБ) — синдром наследственной УО. Синонимы: синдром FRAXA, синдром Х-ФРА, fra(X)-синдром. СМБ широко распространен в популяции: 0,3-1:1000 (мужчины); 0,2- 0,6:1000 (женщины); в среднем — 0,5-1:1000. Такая частота сопоставима только с частотой синдрома Дауна (1:550-650).
У нормальных индивидов в сегменте Xq 27 существуют микросателлитные последовательности ДНК (повторы), содержащие 2-5 пар оснований. В случае мутации в гене FMR1 происходит не привычная замена одного нуклеотида на другой, а увеличение числа копий этих повторов. Экспансия (свыше 230 копий) — это полная мутация, проявляющаяся на клиническом уровне симптоматикой СМБ, а на молекулярном уровне — аномальным метилированием CpG-островка промоторной области гена FMRI, ибо в его 5′-нетранслируемой области содержатся повторы CGG. Эти повторы препятствуют транскрипции, что ведет к отсутствию мРНК и белка FMRP, который относится к РНК-связывающим белкам, циркулирующим между ядром и цитоплазмой.
В цитоплазме белок FMRP формирует РНП-комплекс, связывающийся с рибосомами.
Возможно, в нейронах белок FMRP определяет внутриклеточное расположение и регулирует трансляцию специфических мРНК-
мишеней. По-видимому, полная мутация как причина наследственной УО — это нарушение синтеза белков, необходимых для образования и функционирования синаптических контактов.
Установлена генетическая гетерогенность данного синдрома. Помимо «классической» формы синдрома — FRAXA, обнаружена микроделеция гена FМR1 (без амплификации триплета CGG и аномального метилирования), выделены новые ломкие участки, обозначаемые как формы: FRAXE (тот же триплет CGG, локализация гена в том же сегменте Xq27.3, но дистальнее на 500 тысяч пар оснований от сайта FRAXA; состояние мутации — свыше 200 копий) и форма FRAXF (триплет GCC; локализация гена в сегменте Xq28 на 1-2 млн пар оснований дистальнее сайта FRAXE или ближе к теломере; состояние премутации — 12-26; состояние мутации — свыше 200 копий). Тип наследования СМБ не укладывается в критерии Х-сцепленного рецессивного наследования. Основные клинические признаки: умеренная или глубокая УО с аутистическими расстройствами, мышечной гипотонией и гиперактивностью.
Выявляется черепно-лицевой дисморфизм: большие оттопыренные ушные раковины, прямоугольное лицо, периорбитальная гиперпигментация, высокий и выступающий лоб, тонкий длинный нос, высокое нёбо (часто выявляются подслизистые расщелины нёба или язычка), массивный подбородок, широкие кисти и стопы, макроорхизм, гиперпигментация мошонки. Также встречаются: гинекомастия, гипоспадия, высокая эластичность соединительной ткани (гиперподвижность межфаланговых, коленных и голеностопных суставов), ожирение, пролапс митрального клапана, плоскостопие, сколиоз.
Комбинация всех перечисленных признаков характерна для 50-60\% больных мужчин.
Остальные больные мужчины не имеют дисморфизма лица (10\%), еще часть мужчин (также 10\%) имеют только УО, но без остальных признаков, а оставшиеся 20-30\% мужчин не имеют макроорхизма. Клиническая диагностика СМБ сложна из-за недостаточной специфичности и широкой вариабельности симптомов. Даже наиболее специфический из них — макроорхизм — имеет диагностическую ценность только в пубертатном и постпубертатном периодах, а УО может быть симптомом многих других заболеваний.
Примерно половина больных мужчин — это трансмиттеры, или носители (передатчики) неэкспрессируемого мутантного гена, кото-
рый становится экспрессируемым при передаче последующим поколениям в одной семейной родословной.
Наряду с этим описаны два типа женщин — гетерозиготных носителей гена синдрома, в том числе: дочери нормальных мужчинтрансмиттеров, не имеющие клинических признаков и генетических нарушений, а также родные сестры больных мужчин-трансмиттеров, имеющие клинические признаки болезни в 35\% случаев. Как оказалось, вероятность развития УО зависит от положения индивида в родословной. При этом четко наблюдается феномен антиципации — более раннее и тяжелое проявление симптомов заболевания в последующих поколениях родословной, или парадокс Шермана.
Умственная отсталость, ассоциированная с ломким участком Х-хромосомы
Это второй вариант синдрома наследственной УМО, ассоциированной с ломким участком Х-хромосомы, или синдром FRAXE. Частота в популяции — 1:50 тыс. человек (всего описано около 30 случаев). Основной симптом — задержка интеллектуального развития, задержка речи, развития навыков чтения и письма, рассеянное внимание, гиперактивность; редко наблюдается аутизм. В отличие от классического СМБ здесь нет черепно-лицевого дисморфизма. Характерна экспансия повтора GCC, локализованного в гене FMR2, который экспрессируется в гиппокампе. Эта мутация ассоциируется с аномальным метилированием (гиперметилированием) промоторной области гена FMR2, что ведет к подавлению транскрипции и отсутствию мРНК и белка.
Спиноцеребеллярные атаксии Тип 8
СЦА, тип 8 — это прогрессирующая атаксия с атрофией мозжечка и «оживленными» рефлексами. Причина — экспансия повтора CTG в 3′-терминальном экзоне гена SCA8, экспрессирующемся в тканях головного мозга. Транскрипт этого гена не транслируется и, возможно, служит эндогенной антисмысловой РНК, регулирующей экспрессию других генов. Кроме такой РНК, была выделена РНК, транскрибируемая в ориентации, обратной гену SCA8. Этот первичный транскрипт гомологичен продукту гена KELCH у дрозофилы. Его значение пока не определено.
Тип 10
СПА, тип 10 — это аутосомно-доминантное заболевание, обусловленное экспансией пентануклеотидного повтора ATTCT в интроне 9 гена SCA10.
В норме наблюдается 10-22 нуклеотида, тогда как у больных их число достигает 4500. Патогенез пока не известен.
Тип 12
ЦСА, тип 12 — это редкое заболевание с экспансией повтора CAG в 5′-нетранслируемой области гена PP2А или гена PP55b, кодирующего специфическую для нервной ткани регуляторную субъединицу фермента — фосфатазы 2А (РР2А). Несмотря на локализацию повтора CAG вблизи консервативных промоторных элементов, влияние экспансии на транскрипцию гена PP2А не доказано. Патогенез не известен.
Подходы к диагностике
Клиническая и молекулярно-генетическая диагностика БЭ основана на особенностях феномена экспансии. Первое появление признаков болезни соответствует превышению порога экспансии нуклеотидных повторов, который можно выявить при прохождении клеток через мужской и женский мейоз. К основным диагностическим признакам (их должно быть не менее трех) относятся следующие.
• Первый признак — это усиление тяжести симптомов у больных родственников в каждом последующем поколении в пределах одной семейной родословной, т.е. собственно феномен антиципации (см. выше). Антиципация объясняется ростом числа копий повторов в циклах клеточных (митотических и мейотических) делений либо по отцовской линии (например, рост повторов в мужском мейозе при хорее Гентингтона), либо по материнской линии (например, рост повторов в женском мейозе при миотонической дистрофии). Следует отметить, что у потомков пораженных лиц прогрессирование симптомов будет приходиться на более ранний возраст, а тяжесть течения болезни — нарастать с большей скоростью.
• Второй признак — это корреляция тяжести симптомов с числом повторов у больных как в одной и той же семейной родословной, так и разных семейных родословных.
• Третий признак — это парадокс Шермана или увеличение количества больных лиц в каждом последующем поколении. Причем этот парадокс зависит от того, кто из родителей передает мутацию потомкам. Основа парадокса Шермана — это наличие в семейной родословной здоровых носителей премутации (состояние до превышения порога экспансии).
Например, при синдроме Мартина-Белл переход из состояния премутации в полную мутацию возникает только в женском мейозе. При таком переходе число копий повторов будет заметно выше у сыновей, чем у дочерей женщин-носительниц мутации.
После обнаружения всех трех диагностических признаков врач вправе поставить предварительный диагноз БЭ и после этого обязан направить пациента на уточняющую лабораторную диагностику, принципы которой приведены на рис. 75. Для конкретной БЭ имеется свой вариант ПЦР-анализа, связанный с генокопированием мутантных аллелей. Разработаны два подхода.
Рис. 75. Принцип метода RED (по Cummings C.J. and Zoghbi H.Y., 2000)
Первый подход — экспансия в пределах 150 повторов регистрируется только методом ПЦР-анализа полиморфных повторов с последующей визуализацией продуктов амплификации и только с праймеров, которые фланкируют область повтора. При этом подходе применяется метод RED, позволяющий проводить скрининг генома пробанда на наличие потенциальной экспансии (премутации). Метод RED (обнаружение повторов экспансии) основан на отжиге* олигонуклеотидов — это повторы длиной 15-20 триплетов и последующем лигировании соседних олигонуклеотидов с их денатурацией с матрицы. Циклы повторяются сотни раз до накопления необходимого конечного продукта (см. рис. 75).
Второй подход основан на том, что при количестве копий повтора более 200 диагностика с помощью ПЦР-анализа затруднена, и тогда определение экспансии проводится с помощью блот-гибридизации ДНК-зондами, например, с помощью зондов STB12.3 и Ox 055 при синдроме FraXA или зонда DNA25 при МД.
Кроме того, разработан простой и надежный метод диагностики синдрома фрагильной Х-хромосомы по образцам ДНК с метилированным (инактивированным) и неметилированным (функционально активным) промотором гена FMR1.
Подходы к лечению
Лечение БЭ традиционно симптоматическое.
В случае детского аутизма применяются нейролептики, антидепрессанты, психостимуляторы, а также поэтапная психологопедагогическая коррекция. В России разработан эффективный способ коррекции детского аутизма по методу И.А. Скворцова (1992-1997).
Сущность метода заключается в метамерном микроинъекционном или безыгольном введении микродоз препаратов, изготовленных из мозга животных (церебролизин, церебролизат, церебролизат-М) или других биологических тканей.
* Отжиг — это техника гибридизации или процесс охлаждения ДНК, приводящий к восстановлению водородных связей между парами оснований. Этот процесс противоположен плавлению ДНК или разделению ее цепей под действием температуры (около 95 °С).