Встречная иммунодиффузия по Оухтерлони и Элеку
В 1948 г. Орьян Оухтерлони (Orjan Ouchterlony) и независимо от него Стефан Элек (Stephen Elek) опубликовали разработанную ими методику двойной, или встречной, иммунодиффузии, т.е. диффузии антител и антигенов навстречу друг другу в геле. Эти исследователи обнаружили и использовали физико-химические свойства агарового геля, поры которого имеют размеры, достаточные, чтобы пропустить (дать возможность диффундировать) молекулы свободных антител и многих растворимых антигенов, но задерживающие более крупные по размеру комплексы антител с антигенами. В результате в месте встречи антител с антигенами выпадает осадок; в геле он виден невооруженным глазом как полоса преципитации. Оухтерлони и Элек подобрали концентрацию агар-агара — 1,25-1,5\%.
Порядок постановки реакции следующий.
1. Агар растворяют в физиологическом растворе при 56 °С (температура расплавления агара).
2. В виде золя агар выливают на плоское стекло. При охлаждении до комнатной температуры агар застывает в гель.
3. В застывшем геле пробивают трубочкой-пробойником правильные круглые отверстия (лунки) небольшого диаметра (~2-3 мм).
4. В эти лунки вносят образцы антисыворотки и растворы антигенов.
5. Оставляют на диффузию в течение 16-24 ч, по истечении которых можно наблюдать полосы преципитации, если в исследуемых образцах присутствовали комплементарные друг другу лиганды.
Метод Оухтерлони и Элека иллюстрирует рис. 4.1. (см. также цв. вклейку).
Рис. 4.1. Метод Оухтерлони и Элека: а — линии преципитации, при диффузии двух одинаковых антигенов (АГ) навстречу антителам (АТ), плавно сливающиеся друг с другом; б — линии преципитации, при диффузии двух разных антигенов навстречу антителам, не сливающиеся, а пересекающиеся между собой, «не замечающие» друг друга
Радиальная иммунодиффузия по Манчини
В 1965 г. Джульетта Манчини и соавт., а независимо от них — Д.Л. Фэй и Э.М. МакКелви разработали методику радиальной иммунодиффузии (РИД) в том же агаровом геле для количественного определения содержания в крови (в сыворотке) иммуноглобулинов классов А, G и М.
Для этого потребовалось получить моноспецифические антисыворотки лабораторных животных против очищенных иммуноглобулинов классов М, А и G человека. Моноклональных антител в те годы еще не было.
Манчини, Фэй и МакКелви воспользовались тем физикохимическим свойством агар-агара, что температура его плавления недалека от физиологических температур теплокровных животных, и белки (по крайней мере иммуноглобулины) не претерпевают калечащую денатурацию при температуре плавления агара. Это позволило авторам ввести в состав золя агара, т.е. в жидкую фазу, антисыворотки против иммуноглобулинов разных изотипов, тщательно перемешать раствор перед заливанием на стеклянную пластину. Таким образом, в слое агарового геля оказываются заплавленными антииммуноглобулиновые антиизотипические антитела. В таком геле пробивают круглые луночки, в которые вносят так называемые стандарты (или калибраторы, т.е. растворы иммуноглобулинов с известной концентрацией для построения калибровочной кривой) и пробы испытуемых сывороток и оставляют на свободную диффузию на 16-24 ч.
По истечении этого времени вокруг луночек образуются видимые невооруженным глазом кольца преципитатов. Опыт показал: диаметр колец преципитатов тем больше, чем выше концентрация данного изотипа иммуноглобулинов в исследуемой биопробе. Калибраторы — препараты иммуноглобулинов заданного изотипа с известной весовой концентрацией (мг/мл) — позволяют построить калибровочную кривую и с ее помощью определить концентрации иммуноглобулинов в испытуемых пробах сывороток. Последнее возможно только на прямом отрезке кривой. Для спрямления калибровочной кривой прибегают к несложным математическим действиям, например откладывают на осях координат не диаметр колец преципитации, а квадрат этой величины, и/или не концентрацию изотипа иммуноглобулинов, а логарифм концентрации по основанию 2 или 10. Какой подход окажется приемлемым, подбирают опытным путем в каждой лаборатории.
Хотя метод РИД разработан полвека назад, его нередко используют в лабораториях клинической иммунологии до настоящего времени в силу простоты исполнения, относительно невысокой стоимости реагентов и независимости от приборов.
Метод РИД применим только для названных изотипов иммуноглобулинов (М, А и G), ибо их физиологические концентрации в сыворотках крови попадают в пределы чувствительности метода (мг/мл).
Изотипы IgD и IgE присутствуют в нормальных сыворотках в таких низких концентрациях, которые метод РИД не «видит». Концентрации IgE определяют с помощью высокочувствительных вариантов иммуноферментного анализа — ИФА (см. ниже):
1) общий IgE — ловушечным ИФА, в котором первым слоем на твердой фазе сорбированы моноклональные антиизотипические анти-ε-антитела;
2) для определения антигенспецифичных IgE антигены сорбируют на пористой твердой фазе, где площадь сорбции существенно превосходит дно планшета при одном и том же реакционном объеме; чувствительность определения соответственно существенно выше.
IgD в норме присутствует в сыворотках в следовых количествах, и задача его измерения встает крайне редко (вероятно, только в случаях IgD-продуцирующих плазмоцитом).
В табл. 4.1 и 4.2 приведены нормальные концентрации иммуноглобулинов разных изотипов у людей разного возраста (по данным более современного нефелометрического определения с использованием антиизотипических моноклональных антител и прибора нефелометра).
Таблица 4.1. Концентрации иммуноглобулинов классов М, А и G в сыворотке крови человека в норме
Окончание табл. 4.1
Таблица 4.2. Концентрация изотипов IgG (1, 2, 3, 4), IgA (1, 2) и IgE в сыворотке крови взрослого человека в норме
Поскольку IgE в норме в крови присутствует в низкой концентрации, то для снижения вероятности ошибок при записывании нулей по международной договоренности значения IgE выражают в так называемых международных единицах — МЕ/мл или кМЕ/л (IU/ml, kIU/l). 1 МЕ равна 2,43 нг IgE.
Лабораторная работа 4-1
Определение уровня IgМ, IgA и IgG в сыворотке человека методом радиальной иммунодиффузии
1. Готовят 1,25-1,5\% раствор агар-агара (или синтетической агарозы) в 0,1 М веронал-мединаловом буфере с рН 8,6 (на 1 л воды берут 0,8 г веронала и 4,5 г мединала). Навеску агара (агарозы) заливают буфером и нагревают на водяной бане при 56 °С до полного растворения полимера.
2. В раствор агара добавляют рассчитанное количество (расчет производят, исходя из данных, приведенных в листовке-вкладыше к коммерческим реагентам) антиизотипической антисыворотки,
быстро и тщательно перемешивают. Каждый вариант антиизотипической антисыворотки добавляют в отдельную пробирку с раствором агара (агарозы).
3. Раствор смеси агара (агарозы) с антиизотипической сывороткой быстро выливают на подготовленные обезжиренные стеклянные пластины и кладут их на горизонтальный предметный столик для ровного затвердевания агара/агарозы в гель. Гель прозрачен и бесцветен. На стандартное предметное стекло для микроскопических препаратов (площадью 1875 мм2) требуется примерно 3,2 мл смеси раствора агара с антисывороткой.
4. В геле, подложив под стекло с гелем трафарет, специальной трубочкой-пробойником диаметром 2-3 мм делают два (или больше, что зависит от размеров стекол и количества испытуемых биопроб) ряда лунок. Расстояния между центрами лунок — порядка 1,5 см.
5. Заранее рассчитывают и подготавливают растворы калибровочных иммуноглобулинов (иногда называемые стандартами) в трех известных концентрациях.
6. В три лунки (диаметром 2 мм) заливают автоматической пипеткой (дозатором) по 5 мкл калибровочных растворов иммуноглобулинов, в остальные лунки — также по 5 мкл — заливают испытуемые сыворотки.
7. Стекла помещают во влажную, плотно закрываемую посуду и выдерживают в холодильнике при +4 °С 24-48 ч. За это время происходит спонтанная диффузия белков из лунок в гель и образование преципитатов между иммуноглобулинами, содержащимися в испытуемых сыворотках, и антиглобулиновыми антиизотипическими антителами, содержащимися в агаровом геле. Поскольку диффузия свободно идет во всех направлениях, преципитаты имеют форму правильных колец. Преципитаты видны невооруженным глазом, и диаметры колец измеряют в миллиметрах.
8. Для снижения фона образования неспецифических преципитатов пластины можно отмывать раствором с высокой ионной силой — 5\% NaCl: в течение 48-72 ч промывочный раствор меняют несколько раз.
9. Если задачи работы требуют долгосрочного хранения препаратов, то гель на стеклах с преципитатами фиксируют и красят анилиновыми красителями, прокрашивающими белки, например кумасси-голубым (на 1 г сухого красителя — 50 мл ледяной уксусной кислоты и 150 мл воды).
Окрашенные препараты с кольцами преципитатов промывают и высушивают.
Внешний вид стекол с результатами РИД и калибровочная кривая показаны на рис. 4.2 (см. также цв. вклейку).
Рис. 4.2. Внешний вид стекол с результатами РИД и калибровочная кривая
Иммуноэлектрофорез
В те же 40-е гг. XX в. биохимики научились проводить электрофоретическое разделение белков в гелевых средах. В 1953 г. П. Грабар и К. Уиллиамс (P. Grabar, C.S. Williams) предложили методику иммуноэлектрофореза, которая фактически представляет собой комбинацию электрофоретического разделения белковых смесей и метода Оухтерлони и Элека. В геле с одного края пластины пробивают ряд из несколько лунок, в которые вносят исследуемые на содержание тех или иных интересующих белков растворы или сыворотки пациентов. К пластине с гелем прикладывают электрическое поле и проводят электрофорез. По завершении электрофореза в геле в центре пластины вырезают канавку, параллельную направлению движения белков в электрическом поле. В эту канавку вносят антисыворотку или смесь антител против искомых белков и оставляют на 16-24 ч
для диффузии, после чего регистрируют образующиеся полосы преципитации. Число полос преципитации показывает, к какому количеству компонентов, находящихся в биопробе, в антисыворотке есть комплементарные антитела. Если при электрофорезе использовать калибраторы, т.е. известные белки в достаточных концентрациях, то сравнение полос преципитации материала из биопроб с полосами преципитации с калибровочными белками может стать доказательством наличия в испытуемом материале конкретного белка(ов).
Существует множество модификаций метода иммуноэлектрофореза. На рис. 4.3 проиллюстрировн наиболее простой и употребляемый вариант.
Рис. 4.3. Схема иммуноэлектрофореза по Грабару и Уиллиамсу: а — схема установки; б — результаты электрофореза
В стартовые лунки для электрофореза внесены сыворотки крови двух пациентов — 1 и 2, в канавку в центре пластины по завершении электрофореза проб сывороток внесена смесь антисывороток против основных фракций сывороточных белков — альбуминов, α-, β- и γ-глобулинов. После диффузии сыворотки-1 видны дуги преципитации со всеми основными фракциями сывороточных белков, в том числе с иммуноглобулинами. В сыворотке пациента 2 гамма-глобулины отсутствуют. На основании данных электрофореза пациенту 2 поставлен диагноз агаммаглобулинемии.
«Ракетный» иммуноэлектрофорез
Если к гелю на стеклах, полностью подготовленных для выполнения метода радиальной иммунодиффузии, приложить электрическое поле, то движение компонентов сывороток, в том числе иммуноглобулинов, из лунок в толщу геля будет происходить не в режиме спонтанной диффузии, а в принудительном режиме по силовым линиям электрического поля, что существенно ускоряет процесс. В результате преципитаты станут видны уже примерно через 1 ч, но будут иметь форму не колец, а вытянутых пиков, напоминающих летательные аппараты — ракеты. Такую модификацию метода иммунодиффузии называют «ракетным» иммуноэлектрофорезом. Внешний вид результатов «ракетного» иммуноэлектрофореза показан на рис. 4.4.
Рис. 4.4. «Ракетный» иммуноэлектрофорез: 1 — пациент с агаммаглобулинемией; 2, 3, 4 — калибровочные растворы иммуноглобулинов; 5 — пациент с гипергаммаглобулинемией (возможна миеломная болезнь)
В настоящее время во многих лабораториях изотипы иммуноглобулинов определяют нефелометрическим методом. Специфическими реагентами служат моноклональные антиизотипические антитела. Количество иммунных комплексов оценивают на приборе нефелометре. Калибровку и расчет результатов осуществляют с помощью программного обеспечения.