Важным фактором сохранения биоинформации во времени (в ряду поколений клеток и организмов) является химическая инертность ДНК (см. п. 2.4.5.1). Одного этого, однако, недостаточно. Изменения в ну-клеотидных последовательностях ДНК, искажающие смысл генетической информации, происходят в силу неизбежных ошибок, например, репликации, рекомбинации, репарации ДНК, а также под воздействием агрессивных внутренних (активные формы кислорода или свободные радикалы, температурные колебания) или внешних (кванты космической энергии, УФ и инфракрасное, ионизирующие излучения, определенные химические соединения) агентов.
Механизм репликации ДНК характеризуется исключительной (1 ошибка на 109-1010 спариваний комплементарных нуклеотидов), но не абсолютной точностью. В обеспечении высокой надежности репликации важную роль играет фермент ДНК-полимераза, к функциям которого относится выбор «правильного» нуклеотида из пула нуклео-зидтрифосфатов (АТФ, ТТФ, ГТФ и ЦТФ) и точное присоединение его по длине матричной материнской цепи ДНК, т.е. его включение в строящиеся дочерние цепи (лидирующую и запаздывающую) в надлежащем месте.
Ошибки спаривания (включение ошибочных нуклеотидов), тем не менее, имеют место. Нередко они зависят от образования в клетке химически измененных (таутомерных, возникают с частотой 1 на 104105 «правильных») форм азотистых оснований. Таутомерная форма, например, цитозина образует пару не с гуанином, а с аденином. Тауто-мерные основания существуют, как правило, недолго. При их переходе
в обычную форму в растущей дочерней цепи ДНК в соответствующих парах нуклеотидов нарушается правило комплементарности, что ведет к появлению неспаренных нуклеотидов. Включающийся механизм самокоррекции или редактирования (англ. proofreading) ДНК-текста отщепляет «неправильный» нуклеотид. Функцию молекулярного редактирования выполняет фермент ДНК-полимераза, проявляя в данном случае каталитическую активность нуклеазы. «Редакторская» функция ДНК-полимеразы состоит также в том, что после того, как очередной дезоксирибонуклеотидтрифосфат-предшественник занял место по длине молекулы-матрицы, но до присоединения его к растущей дочерней цепи фермент изменяет свою трехмерную структуру (конформацию) и, если нуклеотид ошибочен, присоединения, скорее всего, не происходит.
По завершении акта редактирования ДНК-полимераза продолжает нуклеотид за нуклеотидом наращивать дочернюю цепь ДНК (рис. 2.28). Следствием саморедактирования (самокоррекции) является снижение частоты ошибок репликации на порядок или в 10 раз — с 10-5 до 10-6.
Наряду с ошибками спаривания, причинами нарушения первичной структуры (последовательности нуклеотидов) ДНК и, следовательно, искажения биоинформации могут быть самопроизвольная (спонтанная) потеря полимером пуриновых азотистых оснований аденина и гуанина (апуринизация; в среднем за сутки диплоидная клетка теряет 5х104 пуринов, что, к примеру, за 70 лет — средняя продолжительность жизни человека в экономически развитых странах — в отсутствие процессов репарации привело бы к утрате ДНК порядка 25\% соответствующих нуклеотидов), химическая модификация азотистых оснований путем присоединения метильных или этильных групп, дезаминирова-ние цитозина, превращающегося при этом в урацил, сшивки соседних тиминовых оснований под действием УФ-облучения, одноцепочечные разрывы молекул ДНК под воздействием рентгеновых лучей или двух-цепочечные под воздействием жесткого α-излучения. Большая часть изменений такого рода устраняется благодаря механизмам молекулярной репарации (восстановления).
Различают дорепликативную (сопровождающую репликацию ДНК) и пострепликативную (затрагивающую уже образованные дочерние биспирали ДНК) репарацию.
В первом случае процесс начинается с идентификации заново образованной дочерней цепи, которая несет ошибку. При этом вторая, исходно материнская цепь биспирали сохраняет «правильную» после-
Рис. 2.28. Самокоррекция или молекулярное редактирование ДНК-текста в процессе репликации
довательность нуклеотидов. Разграничение в биспиралях материнской и дочерней цепей возможно в части случаев потому, что дочерние молекулы ДНК отличаются от материнских сравнительно низким уровнем метилирования. В других случаях основанием для разграничения являются разрывы по ходу дочерней цепи, в том числе (у высших организмов) по границам смежных репликонов. Следующий этап состоит в обнаружении места ошибки и его «обозначении». Нередко такое «обозначение» состоит в разрыве в точке повреждения фосфодиэфирной связи (например, при утрате пуриновых оснований, для чего необходим фермент эндонуклеаза). Затем включается фермент экзонуклеаза. На этой стадии измененный (и «помеченный») участок полимера вместе с примыкающими к нему нуклеотидами «вырезается» и удаляется. На его месте ДНК-полимераза, используя в качестве матрицы «нормальную» материнскую цепь, достраивает отсутствующий фрагмент с соблюдением правила комплементарности нуклеотидов (рис. 2.29). Далее происходит восстановление непрерывности молекулы ДНК (фермент ДНК-лигаза). При химической модификации азотистых оснований путем дезаминирования, алкилирования и др. в репарации ДНК задействованы ферменты ДНК-гликозилазы числом около 20, распознающие соответствующие повреждения, которые удаляются с восстановлением требуемой нуклеотидной последовательности.
Если структурное нарушение молекулы ДНК состоит в образовании тиминовых димеров «-Т-Т-», удалению подлежит достаточно протяженный участок цепи ДНК, содержащей ошибку. Восстановление участка на месте «вырезанного» фрагмента происходит с использованием ферментов дорепликативной репарации, как это описано выше. «Брешь» заполняется «правильными» нуклеотидами с соблюдением правила комплементарности и целостность дезоксирибополинуклеотида восстанавливается.
Механизмы молекулярной репарации ДНК разнообразны. Они отражают характер и условия возникновения молекулярных «дефектов». Механизмы, включающие момент «вырезания» измененных участков, объединены под общим названием эксцизионной репарации. Этими механизмами обеспечивается макромолекулярная репарация ДНК в буквальном смысле, так как «вырезанию» (эксцизия) подвержены измененные фрагменты биоинформационной молекулы, что в функционально-генетическом плане равнозначно удалению ошибки.
Иногда ошибки в виде тиминовых димеров, а также некоторые другие не исправляются описанным образом. В таких случаях включается
Рис. 2.29. Дорепликативная или эксцизионная репарация ДНК (схема)
механизм пострепликативной репарации, в основе которого лежит рекомбинация фрагментов молекул ДНК (рис. 2.30). Механизм постре-пликативной репарации лишен специфичности в том смысле, что в нем отсутствует момент узнавания повреждения. По существу, речь идет о возможности репликации на матрице поврежденной молекулы ДНК без удаления повреждения. Ошибка в нуклеотидной последовательности
Рис. 2.30. Пострепликативная репарация ДНК (схема)
вновь образованной биспирали ДНК, таким образом, сохраняется, но может быть удалена в последующем с использованием эксцизионного (см. здесь же, выше) механизма.
Процессы молекулярной репарации ДНК важны для обеспечения нормальной жизнедеятельности, о чем свидетельствуют серьезные с точки зрения нарушения здоровья людей фенотипические изменения в случае мутаций по соответствующим сайтам (генам). Классический пример — заболевание пигментная ксеродерма или XP (xeroderma pigmentosum: греч. xeros — сухой, derma — кожа; лат. pigmentum — краска). У пациентов наблюдается повышенная чувствительность к солнечному (более точно, УФ) свету, что клинически проявляется в увеличении частоты развития рака слизистой оболочки полости рта в 20 тыс. раз, сокращении длительности жизни и др. Для названного наследственного заболевания характерен аутосомно-рецессивный тип наследования. Установлено несколько генетических форм заболевания (феномен генокопирования, см. п. 4.3.1.1). Все они связаны с мутациями и, следовательно, функциональной «дефектностью» генов, участвующих в контроле процессов репарации повреждений молекул ДНК ультрафиолетовым светом. Предположительно, при отдельных формах нарушено распознавание поврежденного участка, его эксцизия, механизм постре-пликативной репарации и др.
Если клетка попадает в крайне неблагоприятные условия, количество повреждений ДНК может достичь таких величин, что обычные механизмы репарации не справляются с их коррекцией. В подобных ситуациях активируется «аварийная» группа ДНК-репарирующих индуцибиль-ных (в данном случае, побуждаемых к активации обстоятельствами) ферментов SOS-системы (англ. «Save Our Souls» или «Спасите наши души» — международный сигнал бедствия на море и в воздухе). Особенность функционирования SOS-системы заключается в том, что восстановление целостности поврежденных молекул ДНК происходит в срочном порядке без соблюдения правила комплементарности, вследствие чего по завершении процесса в таких молекулах обнаруживается значительное число «свежих» мутаций. При очень высоком количестве повреждений блокируется репликация ДНК и, как следствие, прохождение клеткой митотического цикла. Функционально-биологический смысл блока состоит в том, что клетка не делится и, следовательно, передачи в ряду поколений искаженной в связи с повреждениями ДНК информации не происходит.
Описанные выше способы коррекции и восстановления ДНК-текстов в случае искажения, назовем их активными, дополняются генетическими механизмами, блокирующими или снижающими неблагоприятные фенотипические последствия искажений, если они произошли и не были исправлены. Так, благодаря диплоидности эукариотических клеток измененные (мутировавшие) гены, если они проявляют свойство рецессивности, в гетерозиготах в формировании фенотипа не участвуют и, следовательно, не подпадая под действие естественного отбора, сохраняются в гено(аллело)фондах популяций. Свой вклад в минимизацию неблагоприятных фенотипических последствий нарушений в нуклеотидных последовательностях ДНК, состоящих в замене отдельных нуклеотидов, вносит вырожденность генетического кода (см. п. 2.4.5.2). Уместно вспомнить также явление экстракопирования генов, которые обусловливают контроль жизненно важных клеточных функций, в частности, кодирующих рРНК, тРНК, гистоны (см. п. 2.4.3.3). Механизмы такого рода можно назвать естественными антимутационными.