Неустраненные и/или неисправленные (см. п. 2.4.5.3-a) изменения химической структуры генов (сайтов, нуклеотидных последовательностей ДНК), воспроизводимые в последующих циклах репликации и проявляющиеся у потомков в виде измененных вариантов признака, называют генными мутациями.
Такие изменения можно подразделить на три группы. Мутации первой группы заключаются в замене одного нуклеотида на другой. Напомним, что нуклеотиды, из которых состоят макромолекулы ДНК, различаются по азотистому основанию, что дает право рассматривать главное событие генных мутаций первой группы как замену одного азотистого основания на другое. На их долю приходится порядка 20\% спонтанно (самопроизвольно, без видимой причины) случающихся генных изменений.
Вторая группа мутаций обусловлена сдвигом «рамки считывания», что является следствием изменения числа пар нуклеотидов в пределах гена как в сторону уменьшения (делеция — потеря участка гена), так и увеличения (дупликация — удвоение участка гена). Причиной сдвига «рамки считывания» может стать встраивание (инсерция) в ген участка молекулы ДНК, в частности, вирусной природы (МГЭ, или транспозоны) или из другой хромосомы — транслокация (см.
пп. 1.4.6, 2.4.3.4-д, 2.4.3.4-е, 3.1.4).
мутации
Мутации третьей группы связаны с изменением порядка следования нуклеотидов в пределах гена (инверсия).
Названные варианты генных мутаций в функционально-генетическом отношении отвечают принципу «все или ничего», т. е. мутация либо произошла и проявилась в фенотипе (возможно, через поколения), либо нет. Они случаются как в смысловых (экзоны), так и иных (интроны, области промоторов, энхансеров или сайленсеров, сервисные, регуля-торные или конценсусные сайты, 5′ и 3′ транскрибируемые, но не транслируемые участки транскриптона) нуклеотидных последовательностях ДНК. При типах мутаций, описанных выше, фенотипические эффекты наблюдаются при изменении в молекуле ДНК одного нуклеотида или в биспирали ДНК 1 п.н. Это позволяет в качестве элементарной единицы мутационного процесса (мутон) считать отдельно взятый нуклеотид или пару нуклеотидов.
Относительно недавно стали выделять еще одну группу генных мутаций на основе общности молекулярного механизма, состоящего в прогрессивном росте числа (экспансия), в основном тринуклеотидных тандемных повторов в регуляторной (нетранслируемой) или смысловой (транслируемой) частях генов. В функционально-генетическом плане эти мутации относят к категории «динамических», поскольку фенотипический эффект они дают после того, как количество повторов достигнет и превысит определенный критический минимум. Состояние, при котором в гене есть нуклеотидные тандемные повторы, но число их меньше критического, рассматривают как «премутацию». Наличие последней делает (ген)аллель-носитель нестабильным, что способствует переходу «премутации» в полную мутацию. Для рассматриваемой категории мутаций характерно явление антиципации, т. е. утяжеления клинических проявлений и более раннего начала заболевания в ряду поколений в пределах одной родословной в связи с ростом числа повторов (нарушение принципа «все или ничего»). Наиболее известны тринуклеотидные повторы, хотя описаны и другие формы, например двенадцатинуклеотидные и даже более. Предположительно к мутациям по типу экспансии тринуклеотидных повторов ведет нарушение функции фермента ДНК-полимеразы в последовательных мейотических и митотических циклах. Элементарной единицей (мутон) мутагенеза такого рода на генном уровне является триплет нуклеотидов или последовательность из 3 п.н. в биспирали ДНК, а не отдельный нуклеотид или 1 п.н. (генные мутации по типу замены нуклеотидов или сдвига «рамки считывания»).
Мутации по типу замены нуклеотидов происходят в силу разных причин. Одна из них заключается в том, что под влиянием определенных химических агентов или без видимой физико-химической причины изменяется азотистое основание нуклеотида, уже включенного в молекулу ДНК. Если такое искажение молекулярной структуры ДНК не устраняется механизмами молекулярной репарации (см. п. 2.4.5.3-а), то в ближайшем цикле репликации к измененному ну-клеотиду присоединится нуклеотид, комплементарный именно ему, а не тому, который занимал соответствующее место в молекуле ДНК до изменения. В итоге возникает новая пара нуклеотидов, что приводит к искажению биоинформации в рассматриваемом участке биспи-рали ДНК. Так, вследствие дезаминирования цитозина цитидиловый нуклеотид в паре Ц-Г превращается в уридиловый, комплементарным которому является адениловый нуклеотид. В силу отмеченного при ближайшей репликации образуется пара У-А (рис. 4.5, I), а при следующей — возникает биспираль с парой А-Т вместо пары Ц-Г. Замена пары Ц-Г на пару А-Т происходит также в том случае, если цитозин оказывается метилированным по 5-му углеродному атому. Дезамини-руемый 5-метилцитозин превращается в тимин (рис. 4.5, II), который в ближайшем репликационном цикле дает пару с аденином. Известны примеры включения в строящуюся цепь ДНК нуклеотида с химически измененным азотистым основанием или его аналогом. Если ошибка не обнаруживается, то участие ошибочно включенного «неправильного» нуклеотида в последующих репликационных циклах приводит к замене в соответствующих участках двойной спирали ДНК нормальной пары нуклеотидов на другую, что сопряжено с искажением биоинформации. Так, к адениловому нуклеотиду материнской цепи ДНК может присоединиться нуклеотид не с тимином, а с 5-бромурацилом (5-БУ). При репликации нуклеотид с 5-БУ обычно присоединяет не аденило-вый, а гуаниловый нуклеотид. В следующем репликационном цикле гуаниловый нуклеотид образует пару с цитидиловым. В итоге пара А-Т заменяется парой Г-Ц (рис. 4.6).
Из приведенных примеров видно, что замены нуклеотидов в ДНК происходят до или в процессе репликации первоначально в одной по-линуклеотидной цепи. Если эти изменения не исправляются, то в ходе последующих репликаций они становятся достоянием обеих полину-клеотидных цепей биспирали ДНК. Из сказанного следует, что важным источником генных мутаций по типу замены нуклеотидов являются нарушения процессов репликации и репарации ДНК.
Рис. 4.5. Мутации по типу замены основания (дезаминирование азотистых оснований в молекуле ДНК): I — превращение цитозина в урацил вследствие де-заминирования, замена пары Ц-Г на пару Т-А; II — превращение метилцитозина в тимин, замена пары Ц-Г на пару Т-А
Рис. 4.6. Мутация по типу замены основания (ошибочное включение химического аналога тимина 5-бромурацила при репликации ДНК)
Следствием замены одного нуклеотида в макромолекуле или 1 п.н. в биспирали ДНК является образование нового триплета в нуклеотидной последовательности, кодирующей последовательность аминокислот в полипептиде. В силу вырожденности генетического кода в 25\% таких замен возникает триплет-синоним, что не дает изменений аминокислотной последовательности в соответствующем полипептиде. 2-3\% замен ведут к образованию триплетов-терминаторов (стоп-кодонов), что фенотипически проявляется в трансляции на мутантных и(м)РНК укороченных полипептидов. Еще один вариант генных мутаций по типу замены нуклеотидов приводит к появлению триплетов, шифрующих другие аминокислоты, которые, однако, характеризуются сходными физико-химическими свойствами, являясь, например, также гидрофобными. Это хотя и ведет к изменению аминокислотного состава полипептида, тем не менее не вызывает резкого изменения его характеристик (см. п. 2.4.5.3-а). Таким образом, генные мутации с полномасштабным фенотипическим эффектом составляют порядка 70-75\% всех изменений макромолекулярной структуры ДНК, связанных с нуклеотидными заменами. В качестве примера приведем изменение в гене β-глобина аллеля А («дикий тип») гемоглобина человека на аллель серповидно-клеточности эритроцитов S (мутантный). Фенотипические проявления мутации, ведущее положение среди которых занимает болезнь «серпо-видноклеточная анемия», многообразны (см. рис. 4.3). Суть мутации сводится к замене второго нуклеотида (Т) в триплетах, кодирующих стоящую в β-полипептиде на 6-м месте глутаминовую кислоту (ЦТТ или ЦТЦ), на нуклеотид (А), превращающих их в триплеты, кодирующие аминокислоту валин (ЦАТ или ЦАЦ).
Генные мутации по типу сдвига «рамки считывания» составляют немалую часть спонтанных (самопроизвольных, случающихся без очевидной причины) мутаций. Их число возрастает при действии некоторых химических соединений, в частности акридиновых. Выпадение нуклеотидных пар (делеция) на достаточно протяженных участках макромолекул ДНК типично для мутаций под действием рентгеновских лучей. У плодовой мухи, например, имеется мутация по типу делеции, вызываемая рентгеновским облучением и фенотипически проявляющаяся в изменении окраски глаз, при которой ген, ответственный за цвет глаз, теряет порядка 100 п.н. Действуя на фаг Т4 химическим веществом профлавином, вызывают мутации, состоящие как в выпадении, так и во вставках нуклеотидных пар. При этом фенотипический эффект наблюдается, если в биспирали ДНК появляется или ею теряется всего 1 п.н.
Значительное количество вставок объясняется встраиванием в ДНК МГЭ (транспозонов).
С определенной вероятностью вставки и выпадения п.н. происходят вследствие ошибок рекомбинации, например, при неравном кроссинго-вере (рис. 4.7). Если вследствие неравного кроссинговера в ген встраивается фрагмент псевдогена, говорят о генной конверсии. Такой вариант отражает суть большинства известных мутаций гена фермента 21-гидроксилазы, приводящих к развитию у человека адреногениталь-ного синдрома (врожденная гиперплазия коры надпочечников).
К выпадению или вставкам пар нуклеотидов приводят достаточно частые мутации в сайтах сплайсинга — на границе интронов и экзонов. Эти мутации проявляются в нарушении акта вырезания интронов из пре-и(м)РНК транскрипта. В результате созревающая и(м)РНК лишается части или всего экзона. Еще один возможный вариант — сохранение в и(м)РНК интронной нуклеотидной последовательности.
Считывание информации с ДНК — непрерывный процесс, т. е. ген транскрибируется одним блоком с началом в точке инициации и завершением в точке терминации (транскрибируемые, но не транслируемые 5′- и 3′-участки транскриптона в данном случае в расчет не принимаются, см. п. 2.4.5.5). Учитывая сказанное, а также свойство непере-
Рис. 4.7. Мутация со сдвигом «рамки считывания» вследствие неравноценного обмена наследственным материалом при внутригенном кроссинговере: I — разрывы аллельных генов в разных участках и обмен фрагментами между ними; II — выпадение 3-й и 4-й пар нуклеотидов, приводящее к сдвигу «рамки считывания»; III — удвоение 3-й и 4-й пар нуклеотидов, сдвиг «рамки считывания»
Рис. 4.8. Результат изменения числа нуклеотидных пар в биспирали ДНК. Сдвиг «рамки считывания» вследствие вставки одного нуклеотида в кодогенную цепь нуклеиновой кислоты приводит к изменению аминокислотного состава соответствующего полипептида
крываемости генетического кода (см. п. 2.4.5.2), становится понятным, почему выпадения или вставки нуклеотидных пар, сдвигая «рамку считывания», ведут к изменению содержания генетической информации и, таким образом, представляют собой истинные мутации (рис. 4.8). Иногда следствием сдвига «рамки считывания» становится образование стоп-кодона, что приводит к синтезу укороченного полипетида. Если из биспирали ДНК теряются или в ней появляются дополнительно пары нуклеотидов, количество которых кратно трем, то сдвига «рамки считывания» не происходит (свойство триплетности генетического кода, см. п. 2.4.5.2). На уровне трансляции в таких случаях в образуемых полипептидах соответственно теряются или приобретаются дополнительные аминокислотные остатки.
Мутации по типу изменения положения определенного числа пар нуклеотидов в макромолекуле ДНК происходят вследствие поворота участка нуклеиновой кислоты на 180° (инверсия). Обычно этому предшествует образование соответствующим участком ДНК петли, в пределах которой репликация происходит в направлении, обратном «правильному». На уровне трансляции это проявляется в частичном изменении порядка следования аминокислотных остатков в полипептиде, что меняет его функциональные свойства.
Мутации по типу экспансии нуклеотидных повторов, так же как и другие варианты генных мутаций, случаются как в транслируемых (информативных — экзоны), так и в нетранслируемых (неинформативных — интроны) частях генов, что накладывает свой отпечаток на фенотипи-
ческие проявления. Так, экспансия тринуклеотида (триплета) ЦАГ, кодирующего аминокислоту глутамин, в транслируемой части генов до 40-80 повторов, не нарушая процессов транскрипции и трансляции, приводит к появлению в молекуле полипептида «трека» из соответствующего количества глутаминовых аминокислотных остатков. Такой увеличенный в размерах белок функционально дефектен. Мутации описанного типа лежат в основе развития наследственных нейродегене-ративных патологий, в частности хореи Гентингтона («пляска святого Витта» — одним из ведущих клинических фенотипических проявлений является гиперкинез).
Если мутация локализуется в нетранслируемой части гена, то количество, например, ЦГГ-повторов, соответствующее пороговому значению, исчисляется сотнями и тысячами. Клинико-фенотипические проявления мутаций такого типа разнообразны: синдром Мартина-Белла (ломкая хромосома Х) с классической триадой признаков — олигофрения, дисморфия (нарушения процессов морфогенеза в онтогенезе), макроор-хидизм.
Свои особенности имеют мутации в ДНК митохондрий (мтДНК или хромосома М), что в немалой степени объясняется отличиями в структуре как отдельных генов, так и всего генома названных органелл. Так, митохондриальные гены лишены интронов, а большинство транскрибируемых и(м)РНК лишены 5′ и 3′ нетранслируемых участков (см. п. 2.4.5.5). В сравнении с ядерным геномом митохондриальный геном характеризуется большей плотностью расположения генов в связи с меньшим содержанием межгенной ДНК. Специфика отличает репликацию мтДНК, которая происходит в два этапа. Триплет АУА в мито-хондриальных и(м)РНК, в отличие от образуемых на ядерных генах, кодирует не изолейцин, а метионин, триплет УГА не выполняет функции стоп-кодона, шифруя аминокислоту триптофан, триплеты АГА и АГГ являются стоп-кодонами.
Митохондриальный геном содержит 22 гена для «собственных» тРНК, 2 — для «собственных» рРНК и 13 — для полипептидов, входящих в 5 надмолекулярных комплексов дыхательных цепей органеллы. Предположительно, 1100-1150 генов, участвующих в биоинформационном обеспечении структуры и функций митохондрий, находятся в ядерном геноме. Соотносительный вклад генов ядерной и митохондри-альной локализации в биоинформационное обеспечение функционирования дыхательных комплексов митохондрий иллюстрирует табл. 4.1. Таких комплексов, представляющих собой мультигетеробелковые об-
разования, пять (I-V). Каждый из них представлен совокупностью белковых субъединиц (полипептидов, простых белков или протеинов). Одна часть субъединиц образуется непосредственно в органеллах под контролем митохондриальных генов (мтДНК), тогда как другая — в цитоплазме клетки под контролем ядерных генов (яДНК). Названные комплексы решают различные специфические задачи в рамках процесса окислительного фосфорилирования (дыхательный обмен, аэробный синтез АТФ, см. п. 2.4.6.1).
Таблица 4.1. Биоинформационное обеспечение функционирования митохон-дриальной дыхательной цепи. Взаимодействие ядерного и митохондриального геномов
Все митохондрии эукариотической клетки наследуются по материнской линии, т. е. через цитоплазму яйцеклетки. За редким исключением (зрелые эритроциты млекопитающих и человека) каждая клетка содержит десятки и сотни копий мтДНК.
С учетом сказанного, митохондриальные болезни, в патогенезе которых ведущая роль принадлежит мутационным изменениям, принято делить на 3 группы. Это фенотипические патологические проявления, обусловливаемые, во-первых, мутациями ядерных генов, во-вторых, изменениями непосредственно в мтДНК и, в-третьих, нарушением так называемых межгеномных сигнальных эффектов. В первом случае развиваются митохондриальные болезни с аутосомно-доминантным или аутосомно-рецессивным типом наследования (классическое моногенное менделевское наследование). Характерным проявлением поражений соответствующих сайтов ДНК как ядерной, так и митохон-дриальной локализации (делеции, точковые генные мутации, делеции в сочетании с дупликациями) является пониженный уровень энергоснабжения тканей и органов. Нарушения межгеномных сигнальных эффектов связаны с мутациями ядерных генов-регуляторов. Фенотипически они могут проявляться в изменении количества копий митохондриаль-ной ДНК — деплеция (истощение) митохондриального генетического аппарата — и приводить к тканеспецифическим делециям или дуплика-
циям мтДНК. Типичным представляется присутствие в клетке одновременно митохондрий с мутировавшей мтДНК и «генетически здоровых» органелл со случайным от клетки к клетке количественным соотношением, что определяет вариабильность клинической картины. Вклад в фенотипическую изменчивость, особенно в этих случаях, вносит различная чувствительность клеток разных тканей и структур организма к кислородной недостаточности.
Относительно высокая «поражаемость» мтДНК объясняется тем, что в процессе наработки энергии в органелле (т. е. в непосредственном окружении ДНК органеллы) закономерно образуются АФК (см. п. 2.4.8), а также тем, что митохондрии отличаются более низкой, в сравнении с клеточными ядрами, эффективностью механизмов репарации макромолекул нуклеиновой кислоты в случае их повреждения.
Представления о мутационном процессе (мутагенез), которые были сформулированы в основном классической (домолекулярной) генетикой, уточняются, дополняются и переосмысливаются в свете научных данных современной (в том числе молекулярной) генетики, геномики, протеомики и метаболомики, цитомики и клеточной биологии (см. п. 1.1). Действительно, изменения нуклеотидных последовательностей ДНК происходят не только в биоинформационных участках (экзоны) смысловых транскрибируемых и транслируемых генов, но и в области интронов, промоторов и энхансеров, в сайтах, кодирующих транскрипционные и ростовые факторы, цитокины и рецепторы к ним, в участках, представленных в геномах избыточной ДНК и нуклеотидными повторами разного формата, имеющими различную макромолекулярную организацию (см. п. 2.4.3.4-в, 2.4.3.4-д, 2.4.5.5). В связи с появлением нового семейства «динамических» генных мутаций приходится вносить уточнения в представления об элементарной единице мутагенеза (мутон) на генном уровне структурно-функциональной организации генетического аппарата эукариот (см. здесь же, выше).
В соответствии с представлениями классической генетики частота генных (точковых) спонтанных (самопроизвольных, случающихся без видимой причины — см. п. 4.3.1.4) мутаций у всех живых форм составляет в среднем 10-5-10-7 изменений на один локус нуклеиновой кислоты (в другой редакции — на одну гамету) за поколение. Приводимые значения носят ориентировочный характер. Известно, например, что в геномах живых форм, включая человека, имеются локусы (сайты, нуклеотидные последовательности ДНК), различающиеся по интенсивности спонтанного мутагенеза на 1-3 порядка. В связи с этим предлагается считать,
что у людей частота спонтанно возникающих генных мутаций выражается цифрой 10-11 для наиболее устойчивых участков генома, тогда как для высокомутабильных сайтов («горячие» точки мутагенеза) — 10-4 изменений на локус (гамету) за поколение.