Биосинтез белков в клетках эукариот осуществляется в цитоплазме на рибосомах (или, что более точно, на ассоциациях рибосом с и(м) РНК — полисомах, полирибосомах). Важнейшие задачи, решаемые рибосомой, состоят в создании условий, во-первых, для требуемого пространственного взаиморасположения участников образования белковых молекул и, во-вторых, для осуществления каталитических и регуляторных актов, необходимых для образования аминокислотных последовательностей, соответствующих последовательностям кодо-нов и(м)РНК. Процесс построения полипептида (трансляция), раз начавшись, идет, не прерываясь, вплоть до своего завершения. При этом субъединицы рибосом, тРНК, некоторые белки (например, выполняющие сервисные функции) вовлекаются в процесс неоднократно. Это дает основания говорить о «рибосомном цикле биосинтеза белка».
Главными участниками, объединяемыми пространственно на рибосоме, являются и(м)РНК, тРНК с энергетически активированной аминокислотой в виде аминоацил-тРНК или аа-тРНК («заряженная» тРНК), тРНК, несущая строящийся пептид (пептидил-тРНК). Нелишне подчеркнуть, что необходимая пространственная ориентация участников является непременным условием функциональной состоятельности трансляции. Действительно, если генетический код является неперекрывающимся, то начало считывания информации с и(м)РНК должно приходиться на строго определенный кодон. К примеру, кодирующая (транслируемая) область и(м)РНК начинается с последовательности -АУГ-УУУ-ААА-ЦЦЦ-ЦУГ- и соответствует пептиду: -Мет-Фен-Лиз-Про-Лей-. Допустим, что произошло выпадение первого А. Тогда нукле-отидная последовательность, выраженная в кодонах, примет вид -(А) УГУ-УУА-ААЦ-ЦЦЦ-УГ что соответствует пептиду: -Цис-Лей-Асп-Про- …. Таким образом, отклонение хотя бы на один нуклеотид вызывает сдвиг «рамки считывания», что, неизбежно приводя к изменению последовательности аминокислот, дает функционально «дефектные» полипептиды.
Приращение образуемого пептида происходит путем присоединения очередной аминокислоты, для чего необходимо взаимодействие аа-тРНК и пептидил-тРНК. Два названных участника должны занимать
друг относительно друга строго определенные пространственно близкие позиции, что и имеет место на самом деле.
Решение рибосомой необходимых задач обеспечивается наличием у нее функциональных центров:
• связывания и(м)РНК или М-центр;
• связывания пептидил-тРНК или П-центр;
• связывания аа-тРНК или А-центр;
• пептидилтрансферазный или ПТФ-центр, катализирующий перенос аминокислоты с аа-тРНК на пептидил-тРНК с образованием пептидной связи, а также участвующий в транслокации пептидил-тРНК из А-центра в П-центр.
М-центр расположен на малой субъединице, ПТФ-центр — на большой, аП-и А-центры имеют свои участки на обеих субъединицах (рис. 2.38). Из приводимой схемы видно, что центры находятся на контактирующих поверхностях субъединиц. В действующей рибосоме между названными поверхностями существует ряд полостей и углублений, в которых размещаются аа-тРНК, пептидил-тРНК, а также выделяются две бороздки. Одна из них удерживает растущую пептидную цепь, вторая — и(м)РНК.
Будучи матричным процессом, трансляция включает все необходимые фазы: инициации, элонгации и терминации. О важности фазы инициации уже говорилось. Первым шагом является присоединение и(м)РНК ее нетранслируемой 5′ нуклеотидной последовательностью (см. рис. 2.34) к малой субъедице рРНК еще до сборки органеллы (рис. 2.39). При этом размещение инициирующего кодона после сборки рибосомы будет точно отвечать уровню участка П-центра на большой субъединице. У эукариот роль инициирующего принадлежит
Рис. 2.38. Расположение функциональных центров рибосомы на субъединицах (схема)
Рис. 2.39. Инициация трансляции: последовательность соединения главных участников
кодону аминокислоты метионина — АУГ. Это, однако, не означает, что все образуемые клеткой белки начинаются с этой аминокислоты. Реально полипептид «открывается» аминокислотой, кодируемой следующим триплетом. Метионин, конечно, встречается и во внутренних участках пептидов. Быть кодону метионина инициирующим или шифрующим положение соответствующей аминокислоты в полипептиде решается на уровне метиониновой тРНК. Таких тРНК в клетках две. Одна из них, маркируемая для удобства индексом «i», выбирает инициирующий кодон и(м)РНК. Имеет принципиальное значение, что в эукариотической клетке метионин образует два функционально разных комплексааа-тРНК: один используетсядляинициации — Мет-тРНКiМет, другой — для элонгации — Мет-тРНКiМет. Инициация трансляции требует участия белковых факторов eIF-1, eIF-2 и eIF-3 (eucariotic Initiation Factors): eIF-3 способствует образованию связи и(м)РНК с малой субъединицей и препятствует преждевременному присоединению большой субъединицы, eIF-2 участвует в связывании инициирующей аа-тРНК. В состав инициирующего комплекса входит также гуанозинтрифосфат (ГТФ), который, гидролизуясь до ГДФ и Pi (пирофосфат, неорганический фосфат), обеспечивает энергией, в частности, установку Мет-тРНКМет в П-центре и присоединение большой субъединицы. Таким образом, в дебюте трансляции инициирующая метиониновая аа-тРНК играет роль пептидил-тРНК. Из названных участников акта инициации окончательно не выяснена функция eIF-1. Возможно, этот фактор способствует объединению Мет-тРНКМет, eIF-2 и ГТФ. Представление о
расположении основных участников инициации белкового синтеза дает рис. 2.40.
У прокариот (а также в митохондриях) к метионину, связывающемуся с инициаторной тРНК, присоединяется формильная группа с образованием формилметионина, благодаря чему соответствующий комплекс обозначается как fМет-тРНКifМеt.
Фаза элонгации представляет собой циклический процесс, в ходе которого с каждым очередным «шагом» строящийся пептид удлиняется на один аминокислотный остаток. Суть происходящего сводится к тому, что соответствующая аа-тРНК узнает находящийся в данный момент в А-центре кодон и(м)РНК, комплементарный ее антикодону, и занимает требуемое место на рибосоме (рис. 2.41). Благодаря закономерным пространственным отношениям акцепторные зоны пептидил-тРНК (в П-центре) и аа-тРНК (в А-центре) вместе с находящимися в связи с ними аминокислотами оказываются в каталитическом ПТФ-центре, где между аминокислотами образуется пептидная связь. Присоединение к пептиду новой аминокислоты происходит без энергозатрат. Строящийся пептид, увеличивший свою длину на один аминокислотный остаток, переносится из П-центра в А-центр — пептидилтрансферазная реакция. Таким образом, этот пептид оказывается присоединенным к аа-тРНК А-центра, которая теперь с полным основанием может рассматриваться как новая пептидил-тРНК. В элонгации пептида участвует свой набор белковых факторов — EF-1u и EF-1s (англ., Elongation Factors). Первый из них при участии EF-1s организует сборку комплекса аминокислота-тРНК (аа-тРНК) и ГТФ и вместе с комплексом достигает рибосомы. Обратите внимание, что упомянутые факторы элонгации выполняют функции, сходные с теми, которые характеризуют факторы eIF-2 и eIF-1 фазы инициации. Если антикодон тРНК комплементарен
Рис. 2.40. Инициация трансляции: взаиморасположение главных участников
кодону и(м)РНК в А-центре, то аа-тРНК занимает место в названном центре, ГТФ гидролизуется до Рi и ГДФ с выделением энергии и вместе с EF-1u покидает рибосому.
Хотя местом прикрепления к рибосоме пептидил-тРНК на этом этапе является А-центр, собственно пептидильный фрагмент, предположительно, располагается в зоне П-центра,
что создает стерическое напряжение. Следующим событием является происходящее также с участием каталитического ПТФ-центра и, возможно, с учетом отмеченного напряжения перемещение (трансфер) новой пептидил-тРНК из А-в П-центр. Не исключено, что перемещающийся в область П-центра комплекс пептидил-тРНК, благодаря своей связи через тРНК с «реализованным» кодоном тянет последний также в зону П-центра. Реально это воспринимается как перемещение рибосомы относительно и(м) РНК в направлении ее 3′-конца на один «шаг» (эквивалентен одному кодону или триплету) с экспозицией в зоне А-центра очередного кодона, который будет опознан антикодоном следующей аа-тРНК. тРНК, ранее связанная с П-центром, освобождается и через E-участок (англ., exite) этого центра возвращается в цитоплазму. Здесь она может быть ис-
Рис. 2.41. Фаза элонгации трансляции: основные этапы. 1-й этап — аминоацил-тРНК присоединяется к кодону в А-центре; 2-й этап — между аминокислотами вА-и П-центрах (пептидил-тРНК) образуется пептидная связь; тРНК П-центра освобождается от аминокислоты (пептида) и покидает рибосому; 3-й этап — рибосома перемещается по и(м)-РНК на один кодон так, что тРНК, нагруженная пептидной цепочкой, переходит из А-центра в П-центр; свободный А-центр может быть занят соответствующей аа-тРНК
пользована в новых аа-тРНК. В возвращении пептидил-тРНК в область П-центра участвуют с каталитической функцией белковый фактор элонгации EF-2 — транслоказа и ГТФ как донор энергии.
Описанный процесс продолжается до момента, когда в А-центре рибосомы окажется терминирующий кодон, для которого не существует тРНК — УАА, УАГ или УГА, что соответствует наступлению фазы тер-минации (завершения) трансляции (рис. 2.42). Указанные кодоны узнаются белковыми факторами освобождения или терминации eRF (eucariotic Releasing Factors). Их два: один служит для соединения с триплетами УАА и УАГ, второй — с триплетами УАА и УГА. Вследствие соединения фактора терминации со «своим» кодоном в зоне ПТФ-центра возникает гидролазная активность, разрушающая связь между тРНК и пептидом. Полипептид, тРНК и и(м)-РНК покидают рибосому, субъединицы которой, диссоциируя, поступают в цитоплазму и могут быть использованы в синтезе белка повторно.
Процесс трансляции у эукариот носит характер «конвейера»: на одной и(м)РНК одновременно строится несколько идентичных пептидов. Это означает, что на нетранслируемом 5′-участке одной и той же информационной РНК последовательно оформляются инициаторные комплексы, собираются функционирующие рибосомы и синтезируются полипептиды. Рибосомы, связанные с одной и(м)РНК, образуют полисому (полирибосому). Смысл полисомного формата белкового синтеза понятен и заключается в повышении производительности процесса.
Представление о некоторых параметрах полисомного «конвейера» дают данные по трансляции глобиновых и(м)РНК в ретикулоцитах (клетки — непосредственные предшественницы зрелых эритроцитов млекопитающих, в том числе человека). Для названного объекта среднее расстояние между рибосомами в полисоме равно примерно 80 нуклео-тидам. Так как длина кодирующей (транслируемой) части указанных РНК составляет порядка 430 нуклеотидов, нетрудно подсчитать, что соответствующая полисома содержит 5-6 рибосом. У эукариот рибосомы перемещаются относительно и(м)РНК со средней скоростью до 15 ну-клеотидов в секунду. В таком случае скорость включения аминокислот в строящийся пептид составляет примерно до 5 аминокислотных остатков в секунду. При скорости элонгации в 1-2 аминокислотных остатка в секунду продолжительность трансляции глобиновой и(м)РНК оценивается в 2 мин.
Для осуществления специфической функции образовавшийся полипептид, если он относится к белкам «домашнего использования», дол-
Рис. 2.42. Завершение (терминация) образования полипептида на рибосоме. 1-й этап — присоединение фактора терминации к нонсенс(стоп)-кодону; 2-й этап — высвобождение завершенного синтезом пептида; 3-й этап — диссоциация рибосомы на субъединицы
жен быть адресно доставлен в соответствующую клеточную структуру (лизосома, митохондрия, пероксисома, ядро) или, если этого требует выполняемая им функция (например, трипсиноген, образуемый эк-зокринными клетками поджелудочной железы), выведен из клетки. Примеры механизмов, с помощью которых решаются обозначенные выше задачи, приведены в пунктах 2.4.4.4-а, 2.4.4.4-б, 2.4.4.4-д.
Процесс трансляции в митохондриях во многом сходен с таковым прокариотической клетки.