В земной жизни способом образования новых клеток является ми-тотическое деление уже существующих. Этот процесс организован в форме митотического (пролиферативного) цикла, решающего важнейшую биоинформационно-генетическую задачу — обеспечение клеток дочерних поколений генетической информацией, полноценной в количественном и качественном (смысловом) отношении. Структура цикла и принципы его регуляции рассмотрены в главе 3. Здесь же речь идет о процессе самокопирования (самовоспроизведения) или реплика-ции1 ДНК в синтетическом (S) периоде интерфазы митотического цикла или же в гаметогенезе — перед первым делением мейоза.
Генетический материал эукариот имеет хромосомную организацию. В каждой хромосоме находится комплекс из двух взаимокомплементарных молекул (цепей) ДНК, закрученных в спираль. В ходе репликации вдоль каждой такой молекулы (цепи) «строится» комплементарная полинуклеотидная цепь. Репликация ДНК, таким образом, представляет собой симметричный процесс в том смысле, что обе молекулы биспирали выполняют роль матриц. Дезоксирибонуклеотиды выстраиваются в дочернюю молекулу в соответствии с правилом компле-ментарности: адениловый нуклеотид (А) встает в пару с тимидиловым (Т), а гуаниловый (Г) с цитидиловым (Ц) и наоборот. В итоге на основе одной биспирали ДНК возникают две, идентичные по информационному наполнению. Способ удвоения, при котором каждая возникающая вследствие репликации двойная спираль образована одной предсуще-ствующей материнской молекулой ДНК и одной заново образованной дочерней, называют полуконсервативным (рис. 2.25).
ДНК эукариот удваивается не одним блоком от начала и до конца биспирали, а участками или репликонами со средним размером порядка 30 мкм (1600 тыс. нуклеотидов в так называемой лидирующей цепи биспирали ДНК, см. здесь же, ниже). В ДНК хромосом соматической клетки человека насчитывается до 50 тыс. репликонов. В некоторых ре-пликонах удвоение ДНК происходит одновременно, в других — в раз-
1 Термин «репликация» обычно используют для обозначения самокопирования ДНК; термин «редупликация» чаще используют для обозначения удвоения хромосом.
Рис. 2.25. Полуконсервативный способ редупликации ДНК: I — материнская би-спираль ДНК; II — достраивание комплементарных полинуклеотидных цепей; III — две дочерние биспирали ДНК
ное время. Так, репликация ДНК гетерохроматиновых участков, будучи наиболее поздней, осуществляется в конце периода S. ДНК центромер-ных отделов хромосом удваивается даже не в периоде S интерфазы, а в начале анафазы предыдущего митоза непосредственно перед расхождением дочерних хромосом.
Самоудвоение происходит группами по 10-100 репликонов. Репли-конный формат самокопирования ДНК дает выигрыш по времени. Если бы молекула ДНК реплицировалась одним репликоном, то при скорости синтеза у человека порядка 0,5 мкм/мин (в среднем 100 п.н./с у эука-риот и 1500 п.н./с у прокариот) на удвоение хромосомы 1 (длина 8 см) потребовалось бы около 3 мес. Благодаря полирепликонной организации процесс самоудвоения всей ДНК в S периоде интерфазы занимает у млекопитающих, в среднем, 7-12 ч in vivo и 6-8 ч in vitro. Количество точек начала репликации (активируемых репликонов) и ее скорость меняется в зависимости от стадии индивидуального развития организма, типа клеток и стадии гистогенеза, на которой они находятся, условий их существования. Так, в сперматогониях на одну хромосому приходится в
среднем порядка 40 точек начала репликации (продолжительность периода S 15 ч), а на более поздних стадиях сперматогенеза в сперматоци-тах хромосомы имеют по 5-6 этих точек (продолжительность периода S 100 ч).
Для того чтобы пошла репликация, необходим пул субстратов (предшественников) в высоко энергизированном состоянии — дезок-сирибонуклеозидтрифосфаты тимина, аденина, цитозина и гуанина.
В процессе репликации ДНК выделяют фазы инициации (начало, старт), элонгации (удлинение, приращение) и терминации (завершение, окончание).
Хотя сама репликация происходит в периоде S (синтетический) интерфазы митотического цикла, пререпликативный комплекс образуется в периоде G1 (пресинтетический, постмитотический) интерфазы. Это сложный ферментный комплекс, включающий 15-20 белков, в частности, инициирующие («узнающие») белки, такие как ORS, Cdc6 и Mcm. Названный комплекс, благодаря белкам ORS, связывается с ДНК в точках инициации (начала) репликации. Отличительная черта этих точек — богатство парами А-Т. В таких парах 2 (а не 3, как в парах Г-Ц) водородные связи, что облегчает местную (в точке инициации) денатурацию ДНК с расхождением молекул двойной спирали. Образующиеся при этом одноцепочечные участки ДНК связываются дестабилизирующими белками комплекса (RPA — Replication Protein A эукариот или SSB — Single Strand Binding рroteins прокариот), молекулы которых выстраиваются вдоль полинуклеотидных цепей-матриц и «растягивают» их, делая азотистые основания доступными для присоединения нуклеотидов. Благодаря описанным событиям между соседними точками начала репликации образуется структура, получившая название « репликативный глаз» и соответствующая участку ДНК с разошедшимися («открывшимися» для репликации) полинуклеотидными цепями материнской биспирали. В точках начала репликации (точки ori) образуются репликативные вилки, начинающие процесс в двух взаимопротивоположных направлениях. С этого момента следует говорить не о пре-, а о репликативном комплексе (рис. 2.26). Такие комплексы являются мультимакромолекулярными образованиями, участники которых — специальные белки, в том числе ферменты — обеспечивают три функции: связь необходимых белков, включая ферменты, с точками начала репликации, раскручивание молекул ДНК и ее местную (в зоне репликации) денатурацию, непосредственно репликацию.
Рис. 2.26. Репликационный комплекс (репликационная вилка): главные участники процесса самокопирования ДНК (схема)
Разделение закрученных в биспираль полинуклеотидных цепей ДНК осуществляется ферментом геликазой при участии дестабилизирующего белка RPA. Местное разделение полинуклеотидных цепей при сохранении двуцепочечной структуры на остальном протяжении биспирали должно было бы приводить к образованию супервитков перед репликационной вилкой. Для снятия напряжения, с необходимостью возникавшего бы в такой ситуации, и создания условий для поступательного продвижения репликационной вилки вся материнская биспираль должна была бы быстро вращаться вокруг своей оси. Это высоко энергозатратный процесс. Эволюция нашла выход: ферменты ДНК топоизомеразы I и II , разрывая, соответственно, одну или обе цепи биспирали ДНК, создают возможность для локального вращения, что ослабляет напряжение и препятствует образованию супервитков.
Ферментом, катализирующим образование дочерних полинуклео-тидных цепей, является ДНК-полимераза, представляющая собой сложный мультимакромолекулярный комплекс. В репликативном образовании ДНК эукариот на отдельных этапах участвуют разные ферменты с функцией ДНК-полимеразы. На старте процесса функционирует комплекс из ферментов α ДНК-полимеразы и праймазы (ферменту
праймазе принадлежит роль РНК-полимеразы, что необходимо для синтеза РНК-праймера, см. здесь же, ниже). Указанный комплекс, будучи вытесненным с 3′-конца начавшей рост полинуклеотидной цепи, уступает место δ ДНК-полимеразе. В клетках эукариот присутствуют также β, ε ДНК-полимеразы, участвующие в процессах репарации молекулярных повреждений ДНК, и γ ДНК-полимераза, катализирующая репликацию ДНК митохондрий.
ДНК-полимеразы не способны начать синтез полинуклеотида самостоятельно путем соединения двух дезоксирибонуклеозидтрифос-фатов. Они лишь присоединяют при помощи фосфодиэфирной связи трифосфонуклеотид-предшественник к уже имеющейся нуклеотидной цепи на 3′-конце. В связи с этим инициация репликации ДНК требует предварительного образования затравки или праймера — короткого фрагмента РНК, образующегося при участии репликационного белка RPA и ферментного комплекса «α ДНК-полимераза-праймаза» (рис. 2.27). Из схемы следует, что матрицей для репликации может служить только молекула ДНК, несущая спаренный с ней РНК-праймер, который имеет свободный 3′-ОН-конец.
Построение одной из дочерних полипептидных цепей (лидирующая) на материнской матрице опережает построение второй (запаздывающая). Элонгацию обеих полинуклеотидных цепей ДНК катализирует фермент δ ДНК-полимераза. Кроме собственно фермента, в репликативный комплекс входят белки RFC — Replication Factor C и PCNA — Proliferating Cell Nuclear Antigen. Первый блокирует наращивание РНК-праймера на 3′-конце сверх требуемой длины. Второй играет роль «прищепки» или зажима, крепящего δ ДНК-полимеразу к реплици-руемой полинуклеотидной цепи. Участки ДНК лидирующей цепи синтезируются в пределах репликонов как непрерывные достаточно длинные фрагменты, тогда как ДНК запаздывающей цепи образуется короткими (у эукариот 1000-2000 нуклеотидов) участками — фрагменты Ока-заки. Смысл образования запаздывающей цепи фрагментами Оказаки заключается в том, что в пределах такого фрагмента наращивание молекулы происходит, как обычно, в направлении от 5′ к 3′-концу (по типу шитья «назад иголкой»), так как по-иному ДНК-полимераза не работает.
Завершение репликации (терминация) состоит в удалении РНК-праймеров, заполнении нуклеотидами образующихся при этом «брешей», «сшивании» фрагментов ДНК для восстановления целостности молекулы. В этой фазе процесса участвует группа ферментов: РНК-аза Н или просто нуклеаза Н (удаляет праймер, разрушая РНК в гибридных
Рис. 2.27. Образование РНК-затравки, катализируемое РНК-праймазой, в дебюте репликации ДНК (схема)
РНК/ДНК-комплексах; предположительно, у эукариот эту функцию выполняет δ ДНК-полимераза), β ДНК-полимераза (заполняет «бреши»), ДНК-лигаза («пришивает» фрагмент ДНК, заменивший РНК-праймер, к дочерней цепи). У эукариот репликационный синтез ДНК прекращается при встрече репликационных вилок соседних репликонов.
Полирепликонный формат построения лидирующей цепи и образование запаздывающей цепи фрагментами Оказаки приводит к тому, что по завершении процесса дочерние полинуклеотиды ДНК представлены отдельными участками. Целостность (непрерывность) молекул
восстанавливается благодаря активности фермента ДНК-лигазы, катализирующего, как и ДНК-полимераза, образование межнуклеотидной фосфодиэфирной связи. Особенность действия названного фермента в том, что он «сшивает конец в конец» только такие одноцепочечные участки, которые находятся в составе двухцепочечной ДНК.
Самокопирование вирусных и бактериальных ДНК имеет особенности. У прокариот ДНК реплицируется не прерываясь (как один репликон) с одной точки начала репликации и с образованием двух ре-пликационных вилок. Так как реплицирующаяся хромосома (ДНК) исходно кольцевой формы по конфигурации напоминает греческую букву θ (тета), то весь процесс получил название θ-репликации. У ряда вирусов — бактериофаг λ — наблюдается репликация по типу «катящегося кольца» или σ-репликация. Ключевой фермент репликации ДНК прокариот — ДНК-полимераза III. Функционируя в комплексе примерно с 20 белками, названный фермент строит единым блоком лидирующую и запаздывающую (фрагменты Оказаки) полинуклеотидные цепи. Завершение процесса в запаздывающей цепи требует подключения ДНК-полимеразы I, которая заполняет дезоксирибонуклеотидами участки, образующиеся на месте удаляемых праймеров. ДНК-полимераза I в рассматриваемом процессе выполняет три функции. Наряду с катализом образования ДНК на месте РНК-праймеров (ДНК-полимеразная активность), она обеспечивает удаление этих праймеров в запаздывающей цепи («передняя» или «от 5′ к 3’» экзонуклеазная активность), а также редактирование ДНК-текста путем удаления ошибочно встроившихся неспаренных нуклеотидов на растущем конце цепи («задняя» или «от 3′ к 5’» экзонуклеазная активность). ДНК-полимераза I прокариот является, по-видимому, функциональным аналогом одновременно нуклеазы Н, β ДНК-полимеразы и δ ДНК-полимеразы эукариот. ДНК-полимераза III (функциональный аналог α и δ ДНК-полимераз эукариот) лишена «передней» экзонуклеазной активности. ДНК-полимераза II участвует в процессе молекулярной репарации повреждений бактериальной ДНК.
Завершение (терминация) репликации у прокариот характеризуется своими особенностями. В ДНК прокариот присутствует участок из нескольких коротких (23 п.н.) последовательностей — сайты ter. Репликация завершается по достижении репликационной вилкой указанного участка в том случае, если с вышеназванными сайтами связывается продукт гена tus.
Известны примеры, когда механизм репликации, не будучи связанным с клеточным размножением, решает другие задачи. Это происходит,
в частности, при амплификации (увеличение числа ДНК-копий путем многократного самокопирования) генов рРНК в профазе первого деления мейоза при образовании яйцеклеток у амфибий (см. п. 2.4.3.4-а). В описанном случае используется вариант σ-репликации.
Самокопирование митохондриальной ДНК осуществляется с участием фермента γ ДНК-полимеразы. Репликация ДНК — сложный процесс. У человека, например, за процесс репликации и контроль клеточного (митотического) цикла ответственно более 400 генов. Некоторые из них активны на стадии инициации, другие — на стадии элонгации. Далеко не все детали организации и функционирования «репликационной машины» в достаточной мере ясны.