1. Биохимические методы Биохимические методы направлены на выявление биохимического фенотипа организма. Эти методы позволяют диагностировать наследственные болезни, обусловленные генными мутациями. Биохимические показатели (первичный белковый продукт гена, накопление патологических метаболитов внутри клетки) отражают сущность болезни более адекватно, чем клинические симптомы. С помощью биохимических методов описано более 1000 врожденных болезней обмена веществ. Наиболее распространенными среди таких заболеваний являются болезни, связанные с дефектами ферментов, структурных и транспортных белков. Дефекты ферментов устанавливают путем определения содержания в биологических средах (например, моче и крови) продуктов метаболизма, являющихся продуктом функционирования данного белка. Дефицит конечного продукта, сопровождающийся накоплением промежуточных и продуктов нарушенного метаболизма, свидетельствует о дефекте фермента или его дефиците в организме. Биохимические методы многоступенчаты. Для их проведения требуется аппаратура разных классов. Объектами биохимической могут быть моча, пот, плазма и форменные элементы крови, культуры клеток (фибробласты, лимфоциты). В связи с многообразием биохимических методов, применяемых в лабораторной диагностике наследственных болезней, для эффективного их использования применяется определенная система. Биохимическую диагностику проводят в два этапа. На первом этапе отбирают предположительные случаи заболеваний, на втором — более точными и сложными методами уточняют диагноз заболевания. Первый этап включает качественные и количественные тесты с мочой и кровью на белок, кетокислоты, цистин и гомоцистин, креатинин и другие показатели. Фактически такие исследования можно проводить в каждой больнице. Показания их применения достаточно широкие, стоимость каждого анализа невысокая. Второй этап основан на более точных методах, позволяющих обнаружить большие группы биохимических аномалий. Например, с помощью тонкослойной хроматографии мочи и крови можно диагностировать нарушения обмена аминокислот, олигосахаридов и гликозаминогликанов (мукополисахаридов). Газовая хроматография применяется для выявления наследственных болезней обмена органических кислот. С помощью электрофореза гемоглобинов диагностируется вся группа гемоглобинопатий. Несмотря на сложность и дороговизну, биохимическим методам принадлежит ведущая роль в диагностике моногенных наследственных болезней. Современные высокоточные технологии (жидкостная хроматография, масс-спектрометрия, магнитная резонансная спектроскопия, бомбардировка быстрыми нейтронами) позволяют идентифицировать любые метаболиты, специфические для конкретной наследственной болезни. Показаниями для применения биохимических методов диагностики у новорожденных являются такие симптомы, как судороги, кома, рвота, гипотония, желтуха, специфический запах мочи и пота, нарушения кислотно-основного состояния, остановка роста. Например, в случае фенилкетонурии применение биохимических исследований позволяет своевременно выявить патологию и начать специфические медицинские мероприятия. У детей биохимические методы используются во всех случаях подозрения на наследственные болезни обмена веществ (задержка физического и умственного развития, потеря приобретенных функций, специфическая для какой-либо болезни клиническая картина). Биохимические методы применяются для диагностики наследственных болезней и гетерозиготных состояний у взрослых (гепатолентикулярная дегенерация, недостаточность глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы). 2. Молекулярно-генетические методы Молекулярно-генетические методы— большая и разнообразная группа методов, предназначенная для выявления вариаций (повреждений) в структуре участка ДНК (аллеля, гена, региона хромосомы) вплоть до расшифровки первичной последовательности оснований. В основе этих методов лежат генно-инженерные манипуляции с ДНК и РНК. Исходным этапом всех молекулярно-генетических методов является получение образцов ДНК. Источником геномной ДНК могут быть любые ядросодержащие клетки. На практике чаще используют лейкоциты, хорион, амниотические клетки, культуры фибробластов. Возможность проведения молекулярно-генетического анализа с небольшим количеством легкодоступного биологического материала является методическим преимуществом методов данной группы. Выделенная ДНК одинаково пригодна для проведения различных исследований и может долго сохраняться в замороженном виде. Во многих случаях для успешной диагностики болезни достаточно исследовать небольшой фрагмент генома. Выделение таких фрагментов стало возможным благодаря открытию ферментов — рестриктаз, которые разрезают молекулу ДНК на фрагменты в строго определенных местах. Применение этих ферментов в эксперименте дает возможность получить относительно короткие фрагменты ДНК, в которых легко можно определить последовательность нуклеотидов. Получение достаточного количества таких фрагментов осуществляется путем амплификации (умножения) ДНК при помощи полимеразной цепной реакции. Различают прямую и косвенную ДНК-диагностику моногенных наследственных болезней. При прямой диагностике предметом анализа являются мутации гена. В ДНК-диагностике в настоящее время используются разнообразные прямые методы. Наиболее просто обнаруживаются мутации, изменяющие длину амплифицированных фрагментов ДНК, которые выявляются при электрофоретическом анализе. Для выявления точковых мутаций, небольших делеций и инверсий в исследуемых генах используют методы, при помощи которых можно проанализировать уникальную последовательность ДНК. Примером может служить метод секвенирования — определение нуклеотидной последовательности ДНК. Любые типы мутаций могут быть обнаружены путем прямого секвенирования мутантной ДНК. Для некоторых генов, имеющих небольшие размеры, этот метод с успехом применяется как основной метод сканирования мутаций. Главное преимущество прямых методов диагностики — почти 100 \% эффективность. Косвенное выявление мутаций применяется в тех случаях, когда нуклеотидная последовательность гена еще не известна, но имеется представление о положении гена на генетической карте. Косвенная ДНК-диагностика сводится к анализу полиморфных генетических маркеров у больных и здоровых членов семьи. Маркеры должны быть расположены в том хромосомном регионе, где и ген болезни. Такими маркерами могут быть участки ДНК, существующие в популяции в нескольких аллельных вариантах. Отличия могут быть по составу нуклеотидов, по числу динуклеотидных повторов. На основе вариабельности маркерных участков ДНК можно дифференцировать материнское или отцовское происхождение конкретного варианта маркера, сцепленного с геном болезни. Благодаря анализу полиморфных генетических маркеров можно определить и проследить в поколениях хромосому, несущую патологический ген. Технические приемы в косвенной диагностике те же, что и в прямой диагностике (получение ДНК, электрофорез и другие). Главный недостаток косвенных методов диагностики — обязательное предварительное изучение генотипа как минимум одного пораженного родственника.