Все, что известно в настоящее время о репликации ДНК, выяснено в результате многолетнего экспериментального обоснования основных положений модели структуры и репликации ДНК по Д. Уотсону и Ф. Крику (1953).
Формулируя свою модель, Д. Уотсон и Ф. Крик предположили, что репликация ДНК происходит в несколько последовательных этапов, а именно: а) разрыв водородных связей между двумя полинуклеотидными цепями и разделение последних; б) разматывание полинуклеотидных цепей; в) синтез вдоль каждой из полинуклеотидных цепей новой цепи с комплементарной последовательностью азотистых оснований (рис. 37). Они предположили далее, что разделение и разматывание полинуклеотидных цепей начинается с одного конца молекулы, продолжается по направлению к другому ее концу и сопровождается одновременно идущим с того же конца молекулы синтезом новых полинуклеотидных цепей. Таким образом, в репликации ДНК каждая полинуклеотидная цепь действует в качестве шаблона для вновь синтезируемой полинуклеотидной цепи, причем шаблон обеспечивает выбор определенных нуклеотидных последовательностей из всех возможных последовательностей. В результате этого каждая новая молекула ДНК состоит из одной старой цепи и одной новой (дочерней), комплементарной старой. Этот способ репликации ДНК получил название полуконсервативной репликации.
Полуконсервативный характер репликации ДНК был доказан М. Месельсоном и Ф. Сталем в 1958 г. в экспериментах, выполненных на E. coli. Выращивая бактерии в течение первых делений в синтетической среде, содержащей в качестве источника азота 15N («тяжелый» изотоп), а затем в среде с 14С («легким» изотопом), они показали, что ДНК бактерий после одной генерации роста имела «гибридную» плотность (^Ν/1^), а после двух генераций по плотности наполовину была «гибридной», наполовину «легкой» (14С), т. е. состояла из «тяжелых» и «легких» полинуклеотидных цепей.
У прокариотов репликация ДНК начинается с 0-пункта репликации, составленного примерно 300 нуклеотидами, и продолжается в двух направлениях, образуя репликационную «вилку». Скорость движения «вилки» (т. е. скорость полимеризации) составляет 500 нуклеотидов в секунду. Удвоение молекулы ДНК происходит за 40 мин. Кроме того, у прокариотов действует механизм «вращающееся колесо», по которому репликационная «вилка» двигается
Рис. 37. Репликация ДНК по Д. Уотсону и Ф. Крику
вокруг кольца, генерируя цепи, на которых синтезируются комплементарные цепи.
Изучение ферментативного синтеза ДНК in vitro, компонентами которого являются ДНК-полимераза, дезоксирибонуклеозид 5′-три- фосфаты всех четырех азотистых оснований, ионы магния и ДНК- «затравка», показало, что присутствие всех этих компонентов в смеси сопровождается добавлением мононуклеотидов к растущему концу цепи ДНК, причем они добавляются к 3′ -гидроксильному концу «затравочной» последовательности, и цепь растет в направлении от 5′ — к 3′ -концу. Реакция катализируется ДНК-полимеразой III. После добавления в смесь ДНК-«затравки» синтез ДНК не прекращается даже тогда, когда количество вновь синтезированной ДНК достигает количества ДНК-«затравки». Если же один из компонентов в смеси отсутствует, частота полимеризации снижается во много раз. Отсутствие ДНК-«затравки» полностью исключает реакцию.
Установлено, что для репликации ДНК Е. coli in vitro необходимы белки, детерминируемые генами dna A, dna В, dna С, dna G (белок dna А, белок хеликаза, белок dna С, белок праймаза соответственно, ДНК-гираза, а также белок, связывающийся с одиночными цепями ДНК и АТФ). Комплекс репликативных ферментов и белков получил название ДНК-репликазной системы (реплисомы).
Изучение ферментативного синтеза ДНК in vitro показало также, что копируются обе цепи, но так как цепи ДНК в спирали антипараллельны, то синтез (полимеризация) одной цепи происходит в направлении от 5′- к 3′-концу, тогда как другой — от 3′- к 5′-концу. Синтез цепи в направлении от 5′- к 3′-концу является непрерывным, тогда как синтез в направлении от 3′ — к 5′ — — прерывен, поскольку синтезируются короткие сегменты в направлении от 5′ — к 3′ -концу, которые затем воссоединяются ДНК-лигазой. Короткие сегменты по 1000-2000 нуклеотидов получили название фрагментов Р. Оказаки (рис. 38). Следовательно, рост обеих цепей обеспечивается одной и той же полимеразой (голоэнзим ДНК-полимеразой III). Репликационная «вилка» асимметрична. Цепь, синтезируемая непрерывно, называют лидирующей, а цепь, син- тезируемую непрерывно, — запаздывающей. «Запаздывание» второй цепи связано с тем, что синтез каждого фрагмента Оказаки осуществляется только тогда, когда в результате продвижения лидирующей цепи откроется необходимый участок цепи-шаблона.
У бактерий открыты ДНК-полимеразы I, II, III. Главной является ДНК-полимераза III, которая отвечает за элонгацию цепей ДНК.
Рис. 38. Прерывистость репликации ДНК (синтез фрагментов Оказаки)
Что касается других ферментов, то ДНК-полимераза I заполняет бреши в запаздывающей цепи, тогда как функция ДНК-полимеразы II не совсем понятна.
В случае синтезлидирующей цепи у ДНК-полимеразы имеется спаренный 3′ -конец, что позволяет начать полимеризацию следующей (новой) цепи. Однако для ДНК-полимеразы, синтезирующей «запаздывающую» цепь, необходима «затравка», обладающая спаренным 3′-концом (3′-гидроксильной группой). Эту затравку в виде коротких сегментов РНК синтезирует из рибонуклеозидтрифосфатов ДНК-праймаза на ДНК-шаблоне запаздывающей цепи. Данный процесс характерен тем, что предшествующий синтез коротких сегментов РНК «затравливает» каждую новую инициацию синтеза ДНК. Затем включается ДНК-полимераза, полимеризуя 5′-фосфат дезокси- рибонуклеотидного остатка с 3′ -гидроксильным концом цепи РНК, что приводит к нормальному синтезу цепи ДНК. В последующем «затравочная» последовательность РНК удаляется и брешь заполняется ДНК. Таким образом, роль «затравки» в синтезе фрагментов Оказаки выполняет РНК.
Репликация ДНК эукариотов характеризуется теми же механизмами, что и у прокариотов, хотя скорость полимеризации цепей является меньшей (около 50 нуклеотидов в секунду у млекопитающих). В репликации ДНК эукариотов принимают участие те же ферменты,
что и в случае прокариотов. Размеры фрагментов Оказаки составляют 100-200 нуклеотидов.
Раскручивание двойной цепи ДНК происходит с участием трех разных белков, а именно: а) белки, дестабилизирующие спираль (SS В-белки). Они связываются с одноцепочечными ДНК, помогают ДНК-геликазам раскручивать спираль и обеспечивают протяженный одноцепочечный шаблон для полимеризации; б) ДНК-геликазы, раскручивающие ДНК. Они прямо вовлечены в катализирование раскручивания; в) ДНК-гиразы, которые катализируют формирование негативных супервитков в ДНК.
У эукариотов известно пять ДНК-полимераз (α, β, γ, δ и ε), из которых главную роль в репликации играют полимеразы α и δ. Начинает α-полимераза.
Синтез из ведущей (лидирующей) и запаздывающей цепей, поскольку только она обладает «затравочной» активностью. Дальнейшую элонгацию лидирующей цепи осуществляет δ-фермент, а «запазды- вающей» цепи — ε- или α-ферменты. Завершает репликацию «запаз- дывающей» цепи γ-фермент, который является митохондриальным. При этом он играет роль, присущую в бактериях ферменту poli. Роль β-фермента неясна.
Установлен также белок (циклин), который синтезируется в ^-фазе клеточного цикла и также необходим для репликации ДНК.
Спирализацию ДНК после репликации обеспечивают ферменты ДНК-топоизомеразы. Процесс репликации ДНК характеризу- ется исключительной точностью. Как отмечено выше, фрагменты Оказаки, продуцируемые в ДНК у эукариотов, имеют длину от 100 до 20 пар нуклеотидов. Это, возможно, связано с тем, что у эукариотов синтез ДНК более медленный (1 молекула ДНК в минуту) по сравнению с прокариотами (30 молекул в минуту).
Удвоение хромосом у эукариотов является сложным процессом, поскольку включает не только репликацию гигантских молекул ДНК, но и синтез связанных с ДНК пистонов и негистоновых хромосомных белков. Конечный этап — упаковка ДНК и гистонов в нуклеосомы. Считают, что удвоение хромосом также имеет полуконсервативный характер.
Репликационное поведение хромосом обосновывается на трех фундаментальных свойствах, а именно: непосредственно репликация, сегрегация хромосом при репликации ДНК и делении клеток, а также репликация и предохранение концов хромосом.
0-пункты репликации существуют в хромосомах (сайты инициации репликации) также организмов-эукариотов, состоящих из определенных последовательностей азотистых оснований, причем являются множественными. Эти пункты получили название автономно реплицирующихся последовательностей (ARS-элементов). Определение количества репликационных «вилок» показало, что они удалены один от другого на расстояние 30 000-300 000 пар азотистых оснований. В результате этого по каждой хромосоме двигаются много репликационных «вилок», причем одновременно и независимо одна от другой. Инициацию репликации ДНК обеспечивают белки, связанные с 0-пунктом репликации, а также белки-киназы. Последние ответственны за выход ДНК из репликации. Но как действуют эти механизмы — это вопрос, который еще не получил разрешения.
За сегрегацию хромосом в дочерние клетки ответственны центромеры.
В репликации и предохранении концов хромосом имеют значение так называемые теломеры, представляющие собой повторяющиеся последовательности ДНК длиной 5-10 азотистых оснований. Их роль заключается в обеспечении доступа ДНК-полимеразы к концам цепей ДНК. Вновь образованные хромосомы содержат как старые гистоны, так и вновь синтезированные, контроль которых у млекопитающих осуществляется 20 генными блоками, каждый из которых содержит по 5 гистоновых генов.
Однако репликация эукариотической ДНК имеет и существенное отличие от репликации прокариотической ДНК. Когда ДНК эукариотов метят 3Н-тимидином, а затем экстрагируют из хромосом и изучают методом радиографии, то при этом наблюдают тандемный порядок радиоактивности. Это свидетельствует о том, что одиночные молекулы ДНК содержат множественные 0-пункты репликации. Например, в ДНК клеток млекопитающих 0-пункты встречаются через каждые 40 000-200 000 пар оснований. Экспериментальные данные указывают на то, что репликация хромосомы эукариотов происходит в двух направлениях, поскольку репликационные «вилки» двигаются в двух направлениях из центральных 0-пунктов к репликационным терминусам (пунктам остановки репликации). Сегмент хромосомы, чья репликация находится под контролем одного 0-пункта и двух тер- минусов, является единицей репликации и ее называют репликоном. Размеры эукариотических репликонов зависят от вида организмов, но в общем они составляют около 10-100 нм.
ВОПРОСЫ ДЛЯ ОБСУЖДЕНИЯ
1. В чем заключается классический генетический анализ и применим ли он для изучения наследственности всех организмов?
2. На чем основаны представления о том, что генетическим материалом являются нуклеиновые кислоты?
3. Существует ли связь между размерами генома (в количестве нуклеотидных пар) и видовой принадлежностью организмов? Приведите примеры в обоснование своей точки зрения.
4. Что вы знаете о путях увеличения генома клеток в процессе развития организмов от низших форм к высшим?
5. Определите в сантиметрах общую длину ДНК в клетках человека.
6. ДНК стабильна при рН 11, но РНК деградирует до нуклеотидов при щелочной реакции. Используя учебники по биохимии, объясните причину этого явления.
7. Если субъединицы (β и β’ РНК-полимеразы составляют 0,005 доли от массы общего белка в клетках E. coli, то сколько будет в клетке молекул РНК-полимеразы при условии, что каждая субъединица β и β’ представляет цельную молекулу этого фермента?
8. Почему мочевина денатурирует РНК?
9. Состав оснований (фракция Г + Ц) двухцепочечной молекулы ДНК отражается на показателях плавучей плотности в хлориде цезия и температуры плавления (Тп), при которой половина молекул «плавится» на отдельные цепи. Было найдено, что плавучая плотность равна 1,660 + (0,093 χ фракция Г + Ц), фракция Г + Ц = 2,44 (Тп — 69,3), причем Тп определена в стандартном солевом растворе. Плавучая плотность ДНК крысы составляет 1,702, D. melanogaster — 1,698 и дрожжей — 1,699. Определите фракцию Г+Ц и температуру плавления для ДНК каждого вида.
10. Каково значение митохондриальной ДНК у человека?
11. Что представляют собой транспозируемые генетические элементы? Как их классифицируют?
12. Что представляют собой плазмиды?
13. Что представляют собой повторяющиеся последовательности ДНК и как часто они повторяются в геноме человека?
14. В чем заключается полуконсервативный способ репликации ДНК и каково биологическое значение такого способа репликации?
15. Какова роль ферментов в репликации ДНК?
16. Есть ли разница между репликацией ДНК и репликацией хромосом?
17. Что такое нуклеосома и каковы ее размеры? Какова роль белков в упаковке ДНК в хромосомы?
18. Вычислите число нуклеотидных пар в 1 мегадальтоне двухцепочечной ДНК.
19. Как вы думаете, сколько генов имеется в одной клетке человека при условии, что длина одного гена составляет около 500 пар нуклеотидов?
20. По данным кислотного гидролиза, препарат ДНК, выделенной из клеток мертворожденного плода человека, характеризовался следующим составом (в \%): аденин — 25, тимин — 32, гуанин — 22, цитозин — 21. Каким образом можно объяснить этот необычный результат исследования, руководствуясь данными о структуре ДНК?
21. Какими будут длина и суммарная масса ДНК, если в ней объединить молекулы ДНК из всех клеток новорожденного ребенка, организм которого состоит из 2-1012 клеток?
22. Что представляют собой фрагменты Оказаки и какова их роль в репликации ДНК?
23. Можете ли вы назвать экспериментальные данные, подтверждающие антипараллельную ориентацию цепей в молекуле ДНК?
24. После денатурации ДНК ренатурировали, позволив регибридизацию цепей до 1\% их последовательностей. Затем эту ДНК подвергли обработке нуклеазой I до полного переваривания молекул, после чего ее «разогнали» путем электрофореза в агарозном геле. Каковы результаты электрофореза?
25. Каким образом можно определить генетическую локализацию ^-последовательностей в геноме Е. coli?
26. Почему наследование митохондриальных генов у человека идет по материнской линии?
27. Насколько связана репликация ДНК с хромосомами в клетках человека?