МЕТОДИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ РАБОТЫ

МЕТОДИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ РАБОТЫ

С ИММУНОКОМПЕТЕНТНЫМИ КЛЕТКАМИ

Для выявления отдельных популяций клеток, оценки количественных закономерностей их появления и накопления, изучения маркеров и рецепторов различных популяций лимфоцитов необходимо овладеть методами работы с клетками иммунной системы.

Лабораторная работа 1-1

Выделение органов и тканей иммунной системы

Животное забивают, взвешивают (вес тела животного необходимо знать при вычислении селезеночного индекса), делают разрез по средней линии брюшка, кожу отпрепаровывают и оттягивают на иглах. Находят паховые и подмышечные лимфатические узлы.

Делают разрез мышц брюшины и извлекают брыжеечные лимфатические узлы. Из брюшной полости извлекают селезенку. Вскрывают грудную полость и за грудиной находят тимус. Вырезают бедренные и большие берцовые кости. Выделенные ткани и органы помещают в среду 199 и хранят при температуре тающего льда (0-2 °С). Приготовление клеточных суспензий идет при температуре тающего льда в чашках Петри или бюксах в стерильных условиях.

Получение клеточных суспензий из костного мозга

Для получения клеточной суспензии из костного мозга можно использовать бедренные, большие берцовые и плечевые кости. Кости очищают от прилегающих тканей при помощи пинцета и скальпеля, остатки тканей счищают марлей, срезают эпифизы и при помощи шприца с иглой соответствующего диаметра вымывают костный мозг 2-3 мл среды 199 (охлажденной до 0-2 °С) в центрифужную пробирку. Осторожно, избегая образования пены, клетки суспензируют, пропуская взвесь небольшими порциями через шприц. Полученную суспензию клеток дважды отмывают средой 199 при центрифугировании (250-500 об/мин 10 мин). Hадосадочную жидкость сливают (отбирают), клетки ресуспензируют в свежей среде 199. В полученной суспензии подсчитывают общее количество ядросодержащих клеток и определяют их жизнеспособность (см. ниже).

Получение клеточной суспензии из лимфатических узлов, тимуса и селезенки

Лимфатические узлы (подмышечные, паховые, брыжеечные и др.), тимус или селезенку очищают от жира и соединительной ткани. Очищенные лимфатические узлы, тимус или селезенку переносят в чашку Петри или бюкс с небольшим количеством среды 199 (0,5 мл) и фрагментируют ножницами (можно осторожно ворсить скальпелем, разрывать препаровальными иглами или раздавливать в гомогенизаторе) до получения однородной клеточной взвеси. К полученной взвеси добавляют еще 2,5 мл среды 199 и фильтруют ее через капроновую сетку в центрифужную пробирку. Дважды отмывают средой 199 при центрифугировании в течение 5 мин при 1000 об/мин. Супернатант удаляют, а к осадку добавляют свежей среды 199 и ресуспензируют пастеровской пипеткой, шприцем с иглой или автоматическим дозатором. В полученной клеточной суспензии подсчитывают

число ядросодержащих клеток в 1 мл и определяют их жизнеспособность (см. ниже).

Подсчет числа ядросодержащих клеток в суспензии

Взвесь клеток тщательно перемешивают шприцем с иглой или автоматическим дозатором. В лунке круглодонного планшета смешивают 20 мкл взвеси клеток и 180 мкл 5% раствора уксусной кислоты. Таким образом, первоначальная взвесь клеток разводится в 10 раз (эритроциты под влиянием уксусной кислоты лизируются, у ядросодержащих клеток разрушается оболочка, но ядра сохраняются). Полученную смесь опять тщательно перемешивают и затем заполняют ею камеру Горяева. Под микроскопом в сетке камеры Горяева подсчитывают число клеток в 100 больших квадратах (25 «окон»). Подсчет производят в 2 сетках камеры и выводят среднее число клеток.

Принцип подсчета числа клеток в 1 мл суспензии

Полученное число клеток соответствует объему в 100 больших квадратах, т.е. 0,4 мм3 (площадь квадрата 1/25 мм2, высота камеры 0,1 мм). Следовательно, если в камере насчитали 100 клеток, т.е. в 0,4 мм3 находится 100 клеток, то в 1000 мм3 - 250 000 клеток, а с учетом разведения клеток в 10 раз общее число ядросодержащих клеток в 1 мл составит 50х106. По упрощенной схеме подсчета полученное среднее число клеток делят на 4 и умножают на 105. Для определения общего числа ядросодержащих клеток в органе количество клеток в 1 мл умножают на количество среды, в которой был суспензирован орган или ткань.

Х = А / 4 × 105,

где Х - количество клеток в 1 мл клеточной суспензии; А - количество клеток в 25 квадратах.

Для определения общего числа ядросодержащих клеток в органе количество клеток в 1 мл умножают на количество среды, в которой были суспендированы орган или ткань.

Определение жизнеспособности клеток

Определение жизнеспособности клеток производится методом суправитальной окраски 0,1% раствором трипановой сини.

Hа предметное стекло наносят каплю взвеси клеток и 1 каплю 0,1% раствора трипановой сини. Через 30-60 с окрашенную каплю взвеси покрывают покровным стеклом. Избыток суспензии удаляют промакиванием фильтровальной бумагой и под микроскопом подсчитывают число живых (неокрашенных) и погибших (синих) клеток на 100 кариоцитов. Выводят процент гибели клеток.

Раствор трипановой сини готовят заранее. Порошок растворяют в бидистиллированной воде из расчета получения 0,2% раствора, который фильтруют. Это маточный раствор. Рабочий раствор приготовляют перед опытом: маточный раствор разбавляют 4,25% раствором хлористого натрия до нужной концентрации (1 капля гипотонического физиологического раствора + 3 капли трипановой сини).

Вопросы и задания

1. Дайте определение инбредных животных.

2. Опишите принцип получения конгенных линий мышей.

3. Какие биологические материалы используются для исследования иммунной системы?

4. Перечислите основные этапы получения клеток костного мозга у мышей.

5. Перечислите основные этапы выделения клеток из периферических органов мышей.

6. Как подсчитать количество клеток в 1 мл клеточной суспензии и определить жизнеспособность клеток?

YAmedik.org