ПРИНЦИПЫ ИММУНОДИАГНОСТИКИ

ПРИНЦИПЫ ИММУНОДИАГНОСТИКИ

Многие инфекционные заболевания сегодня претерпели изменения, что выражается в увеличении удельного веса легких, стертых, бессимптомных форм (дизентерия, скарлатина, коклюш, дифтерия, холера), аллергического компонента, высокой частоте микст-инфекций. Все это затрудняет традиционную диагностику заболеваний, поэтому значимость иммунодиагностики возрастает. Она базируется на выявлении Аг возбудителя или специфических иммунных (аллергических) сдвигов в организме больного.

Методы, основанные на обнаружении Аг в сыворотке крови, секретах, выделениях или пораженных органах

(указанными методами пользуются для ранней диагностики инфекционных заболеваний).

Реакция иммунофлюоресценции (РИФ) основана на соединения Аг бактерий, риккетсий или вирусов со специфическими АТ, меченными соответствующими красителями (изотиоцианатом флуоресцеина). Метод используется для экспрессной диагностики гриппа,

других респираторных заболеваний, микоплазменной инфекции, дизентерии, брюшного тифа, сальмонеллеза, бруцеллеза, малярии, чумы, геморрагического нефрозо-нефрита, туляремии, сифилиса, токсоплазмоза, бешенства.

Реакция непрямой гемагглютинации (РНГА) используется для раннего обнаружения Аг в организме больного и объектах внешней среды при дизентерии, брюшном тифе, сальмонеллезах, колиэнтеритах, холере, чуме, сибирской язве, ботулизме.

Реакция гемагглютинации (РГА) и реакция торможения гемагглютинации (РТГА) применяются для экспрессной идентификации вирусных инфекций (гриппа, парагриппа, эпидемического паротита, полиомиелита, аденовирусов, вирусных энцефалитов и др.).

Реакция нейтрализации Аг (РНА) используется для обнаружения бактериальных экзотоксинов (клостридий, коринебактерий, стафилококков и др.), а также вирусов. Она применяется для диагностики кори, паротита, краснухи, вирусных энцефалитов, денге, омской и геморрагической лихорадок. Позитивные результаты данная реакция дает через несколько сут - 2-3 нед от начала заболевания.

Реакция преципитации (РП) может осуществляться в жидкой фазе, агаровом геле (простая одномерная диффузия) и в виде двумерной диффузии, радиальной диффузии, электрофореза и т.д. Является точным методом диагностики менингококковой инфекции, трипаносомоза, полиомиелита, сибирской язвы, малярии, вирусного гепатита В. Ее также можно применять для идентификации возбудителей брюшного тифа, дизентерии, клостридиозов, бруцеллеза, стрептококкозов и токсинов бацилл столбняка, газовой гангрены.

Радиоиммунный - является одним из наиболее чувствительных методов иммунодиагностики. Его применяют для выявления Аг гепатита В у больных. Для этого к исследуемой сыворотке добавляют референс-сыворотку, содержащую АТ к вирусу гепатита В. Смесь инкубируют 1-2 дня, затем добавляют к ней референс-антиген, меченный I125+ и продолжают инкубацию еще 24 ч. К образовавшемуся растворимому комплексу Аг - АТ добавляют преципитирующие антииммуноглобулины против референс-сыворотки, что приводит к образованию преципитата. Результат реакции учитывают по наличию и числу импульсов в преципитате, зарегистрированных счетчиком.

При наличии в исследуемой сыворотке антигена, связывающегося со специфическими АТ, последние не поступают в связь с меченым

Аг, и поэтому он не обнаруживается в преципитате. Радиоиммунный метод позволяет выявить Аг вируса гепатита В и других возбудителей в ранний срок заболевания у 60-80% больных.

Иммуноферментный анализ достаточно чувствителен и прост. Реакцию обычно ставят в пластиковых планшетах, к стенкам лунок которых фиксируют АТ к искомому Аг. Далее в лунку вносится исследуемый объект, содержащий искомый Аг. Последний соединяется с АТ, образуя комплекс Аг - АТ. Исследуемый субстрат удаляют и вместо него вносят АТ, меченные каким-либо ферментом, например, пероксидазой хрена. Указанные АТ присоединяются к комплексу Аг - АТ и также фиксируются к стенке лунки. Далее в систему вносят вещество, дающее цветную реакцию в присутствии пероксидазы хрена. По интенсивности окрашивания оценивается реакция. Данный метод применяется для диагностики различных инфекций, например СПИДа.

Методы, основанные на обнаружении антител

Обнаружение АТ представляет собой метод более позднего его образования обычно в периоде реконвалесценции или в отдаленный период после перенесенного заболевания. Известно, что у больных могут содержаться в крови АТ, приобретенные в результате перенесенного ранее заболевания или вакцинации. Они могут «маскировать» иммунный ответ на конкретную инфекцию, а иногда существенно влиять на его активность и напряженность. Известно, что малое количество АТ стимулирует синтез гомологичных иммуноглобулинов в инфицированном или вакцинированном организме, а большое - угнетает этот синтез.

Значит диагностическое значение имеет не столько факт обнаружения АТ, сколько определенная величина их титра, характерная для той или иной инфекции.

Еще более показательно четырехкратное увеличение титра АТ в динамике заболевания. Однако для этого необходимо повторное исследование с интервалом в 7-14 дней, что несколько задерживает постановку диагноза, а при острых инфекциях с непродолжительным течением (грипп, корь, дизентерия) исключает возможность его подтверждения в разгаре заболевания.

Необходимо также учитывать, что серологические реакции отличаются неабсолютной специфичностью ввиду наличия общих Аг или отдельных детерминант специфичности возбудителей, относящихся к одному или даже разным видам.

В ряде случаев это может привести к заблуждению, например, при постановке РСК или РТГА с гриппозными Аг сероконверсии иногда более выражена к вирусу, с которым организм сталкивался ранее, чем к вирусу, вызвавшему заболевание в данный момент.

Диагностическую ценность серологических исследований может повысить дифференцированное определение АТ, относящихся к разным классам иммунных глобулинов (IgM и IgG). IgM образуются в более ранние периоды заболевания, поэтому могут служить показателем недавнего инфицирования. В последующем они сменяются АТ, принадлежащими к IgG. IgM свойственна термостабильность (они разрушаются при температуре 62°С), способность расщепляться под действием меркаптоэтанола, что позволяет дифференцировать их от IgG.

Понятно, что специфичность серологических тестов зависит также от качества применяемых диагностикумов: правильности получения, обработки и хранения исследуемых сывороток, техники выполнения реакций. Например, при постановке реакции связывания комплемента (РСК) непригодны гемолизированные сыворотки.

При постановке РНГА с сенсибилизированными эритроцитами барана необходимо освободить исследуемые сыворотки от агглютининов к этим эритроцитам.

Непригодны для исследования сыворотки, имеющие признаки бактериального загрязнения, с посторонними примесями, многократно замороженные и оттаиваемые, хранящиеся при комнатной температуре.

АТ в сыворотке крови больного выявляются с помощью тех же серологических реакций, которые применяются для обнаружения Аг. Различия заключаются в том, что для определения АТ используют стандартные антиген-диагностики, которыми могут служить живые или инактивированные возбудители, растворимые Аг или эритроцитарные антигенные препараты.

Реакция связывания комплемента имеет наибольшее применение для иммунодиагностики, основанной на обнаружении АТ при стрептококковых, менингококковых инфекциях, коклюше, микоплазменной пневмонии, гриппе, паротите, кори, краснухе, цитомегалии, сыпном тифе, риккетсиозах, трипаносомозе, вирусных энцефалитах, чуме, гонорее, сифилисе, сапе, токсоплазмозе, бруцеллезе, листериозах. Это объясняется высокой чувствительностью и специфичностью метода, возможностью использования его для текущей и отдаленной

рет р оспективной диагностики. Недостаток РСК - ее громоздкость, необходимость постоянного наличия эритроцитов, комплемента, антигена-диагностикума, продолжительность постановки, относительно позднее выявление АТ в диагностических титрах (10-14-й день заболевания).

В последние годы все шире применяется реакция непрямой гемагглютинации с использованием эритроцитов, сенсибилизированных растворимыми Аг возбудителя коклюша, туберкулеза, микоплазменной инфекции, кори, цитомегалии, сыпного тифа, малярии, риккетсиозов, чумы, туляремии, токсоплазмоза, эшерихиозов, дизентерии, брюшного тифа, бруцеллеза, листериоза. При наличии качественных эритроцитарных диагностикумов РНГА по специфичности и чувствительности не уступает РСК.

РТГА со стандартными вирусными диагностикумами используется для обнаружения АТ к вирусам гриппа, паротита, кори, клещевого и японского энцефалитов, желтой лихорадки, паппатачи, полиомиелита. Диагностические титры АТ в сыворотке крови больных, выявляемые с помощью РТГА, нарастают медленно (к 10-20-му дню заболевания), обычно не достигают высокого уровня (1:20-1:320). РТГА менее чувствительна и специфична, чем РНГА. Ее используют в качестве вспомогательного средства текущей и ближайшей ретроспективной диагностики.

Реакция нейтрализации АТ (РНА) - очень чувствительный и специфичный метод обнаружения АТ при стафилококковых инфекциях, паротите, кори, ветряной оспе, вирусных энцефалитах, денге, омской геморрагической лихорадке, паховом лимфогранулематозе, столбняке, ящуре, бешенстве. Однако он требует постоянного наличия опытных лабораторных животных, куриных эмбрионов или культур ткани, а также проведения длительных наблюдений (от нескольких дней до нескольких недель), что снижает возможности использования метода в клинике инфекционных болезней.

Реакция преципитации в описанных выше вариантах применяется для выявления АТ к возбудителям полиомиелита, менингококковой инфекции, трипаносомоза и некоторых других заболеваний. В клинической практике для обнаружения АТ у больных РП имеет ограниченное значение в связи с трудностью получения концентрированных растворимых Аг для ее постановки.

ПЦР - полимерная цепная реакция - специфическая амплификация ДНК, инициируемая синтетическими олигонуклеотидными праймерами. Реакция осуществляется in vitro с использованием ДНК-

полимеразы и олигонуклеотидных праймеров (затравок), комплементарных участкам, ограничивающим амплифицируемый дуплексный сегмент. В ходе ПЦР определяется на 100000-1000000 клеток.

Кожные аллергические реакции

Кожные пробы используются для диагностики стрептококковой инфекции, туберкулеза, Ку-лихорадки, туляремии, токсоплазмоза, актиномикоза, лепры, сапа, сибирской язвы, пахового лимогранулематоза, трахомы, листериоза, бруцеллеза.

При сибирской язве, туляремии, Ку-лихорадке кожные пробы со специфическими Аг становятся положительными на 3-5 день заболевания, и поэтому они служат методом ранней диагностики. При вялотекущих хронических инфекциях (паховом лимфогранулематозе, лепре, сифилисе, токсоплазмозе и др.) специфическая кожная аллергия выявляется закономерно через 3-4 нед после начала заболевания и является вспомогательным методом диагностики, применяющимся в разгаре заболевания, а также методом проверки эффективности лечения в период реконвалесценции.

Для постановки аллергических кожных проб (чаще внутрикожных, иногда накожных) используются растворимые Аг возбудителей или извлеченные из микробных клеток аллергенные субстанции (антраксин, малеин, тулярин, лепромаин). Кожные пробы отличаются специфичностью, технической простотой постановки, возможностью получения ответа через 28-72 ч.

При некоторых инфекциях (туляремии, бруцеллезе, токсоплазмозе) положительные кожные пробы сохраняются много лет и служат методом ретроспективного диагноза, выявления восприимчивых лиц, нуждающихся в вакцинации (при туляремии и туберкулезе). Введение Аг (туберкулиновые пробы) в сенсибилизированный организм иногда сопровождается тяжелыми побочными явлениями, осложняющими инфекционный процесс. Например, выраженные кожные пробы могут сопровождаться активацией очагов в легких, кожные пробы с токсоплазмином иногда обусловливают обострение токсоплазмоза глаз, введение бруцеллина - усиление боли в суставах, по ходу нервов, обострение воспалительных очагов, увеличение печени и селезенки. В редких случаях после постановки внутрикожных проб развиваются тяжелые анафилактические реакции. В последние годы рекомендуется ограничить постановку этих проб больным инфекционными заболеваниями и заменять их более безвредными для организма методами определения сенсибилизированных клеток.

Методы выявления сенсибилизированных клеток

Они включают определенные изменения активности, динамики альтерационных изменений ядра и показателя нейтрофилов (ППН), лизиса лейкоцитов (иммунолейкоцитолиз), исчезновение зернистости (дегрануляция) лейкоцитов-базофилов, лейкергии (агломерации) лейкоцитов, реакции бластной трансформации лимфоцитов, реакция торможении миграции лейкоцитов (РТМЛ), исследование образования специфических розеток с эритроцитами барана в присутствии каких-либо агентов, изучение других феноменов, возникающих при контакте сенсибилизированных клеток с аллергеном. Перечисленные тесты отличаются определенной информативностью и специфичностью. Ограничивает использование указанных методических подходов громоздкость постановки, необходимость наличия специально подготовленных стандартных аллергенов, сложных питательных сред при осуществлении реакции бластной трансформации лимфоцитов и других компонентов.

Имеются сведения об успешном применении ППН в реакции иммунолейкоцитолиза для постановки диагноза и клинического прогноза при дизентерии, туберкулезе, вирусном гепатите, стрептококковых инфекциях, токсоплазмозе, бруцеллезе. Преимущество этих тестов - простота постановки, непродолжительное время исследования, абсолютная безвредность для организма больного, возможность проведения анализа со многими аллергенами и в небольшом объеме крови.

YAmedik.org