ПРИНЦИПЫ ОЦЕНКИ ИММУННОГО СТАТУСА

ПРИНЦИПЫ ОЦЕНКИ ИММУННОГО СТАТУСА

Иммунный статус определяется количеством и активностью лимфоидных и фагоцитарных клеток, находящихся в циркуляции, состоянием системы комплемента, факторов неспецифической резистентности, киллерными клетками, иммуноглобулинами, специфическими АТ, ИЛ и другими показателями.

Все параметры иммунного статуса можно разделить на: 1) неспецифические, отражающие общие изменения иммунной системы; 2) связанные с данной патологией опосредованно; 3) специфические, устанавливающие конкретные иммунные механизмы заболеваний.

Неспецифические показатели. Наиболее широко распространенные методы оценки иммунного статуса связаны с лимфоцитами. Для их выделения разработаны различные методические приемы.

Создаются градиенты плотности сред, задерживающие именно эти клетки за счет их плотности: фиколл-верографин, фиколл-гипак, плазма-перколл и др. В ряде случаев от эритроцитов освобождаются с помощью различных лизирующих растворов.

Оценка состояния трех основных звеньев иммунитета Т-, В- и фагоцитарного разделяется на количественную и функциональную.

Количественное тестирование популяций и субпопуляций лимфоцитов основано на характеристике специфических для каждого вида клеток рецепторов, по их способности связываться с Аг либо с клетками. Так, CD3 (Т)-лимфоциты, например, несут рецепторы к эритроцитам барана и образуют с ними так называемые Е-РОК. Подсчитав процент таких клеток и переведя его в абсолютные значения, можно определить содержание CD3 (Т)-лимфоцитов. CD19 (В)-клетки обра-

Рис. 7. Методы количественной оценки Т- и В-клеток (Б.Н. Райскис и соавт.)

зуют розетки либо с эритроцитами мышей, либо с эритроцитами быка, нагруженными АТ против них и комплементом - ЕАС-РОК.

Более чувствительной является идентификация клеток с помощью моноклональных АТ против маркерных Аг популяций и субпопуляций лимфоцитов. Исследуемые лимфоциты обрабатывают моноклональными АТ (анти-CD), затем либо диагностикумами, нагруженными АТ против «первых» АТ, либо АТ и их Fab-фрагментами (против «первых» АТ), меченными флуорохромами, дающими специфическое свечение в люминесцентном микроскопе. Созданы лазерные сортеры (проточные цитофлуориметры) для выявления субпопуляций лимфоцитов, меченных таким образом моноклональными АТ.

Для оценки функциональной активности клеточного звена иммунитета используют 4 группы методов.

1. Постановка кожных проб ГЗТ.

2. Стимуляция лимфоцитов in vitro в РБТЛ.

3. Функциональная оценка CD4-лимфоцитов.

4. Функциональная оценка CD8-клеток (киллерных клеток и т.д.).

Рис. 8. Методы оценки функциональной активности Т-клеточного звена иммунитета (Б.Н. Райскис и соавт.)

Для постановки кожных проб используется: очищенный туберкулин (реакция Пирке), паротитный, стрептококковый, столбнячный, дифтерийный Аг, трихофитин, кандидин, стрептокиназа, динитрохлорбензол и др.

Стимуляция лимфоцитов в РБТЛ основана на способности лимфоцитов при определенных условиях превращаться, в увеличенные бластоподобные клетки, активно синтезирующие ДНК.

Для характеристики функции CD4-лимфоцитов мононуклеарные клетки крови инкубируют с поликлональным активатором лимфоцитов митогеном лаконоса и количественно измеряют индуцированную им продукцию иммуноглобулинов. Далее в систему вносят клетки с предполагаемой хелперной способностью и определяют прирост образования иммуноглобулинов.

Для оценки функции CD8-лимфоцитов воспроизводится описанная выше методика, но добавляют в культуру клетки с супрессорной активностью, регистрируя снижение суммарных иммуноглобулинов.

Одним из методов определения функциональной активности CD19- лимфоцитов является оценка синтеза иммуноглобулинов в культуре этих клеток, а также выявление в сыворотке крови, слюне, кишечном содержимом количества иммунных глобулинов основных классов. Для этого используется метод двумерной диффузии в агаровом геле, разработанный Манчини (в лунки агарового геля, содержащего АТ к различным классам иммуноглобулинов, добавляют искомые сыворотки, содержащие Ig, образуются кольца преципитации, размер которых по номограммам позволяет определить концентрацию Ig разных классов).

Дополнительным показателем в оценке гуморального иммунитета является определение концентрации естественных АТ, например, изогемагглютининов (титр в норме 1:16 - 1:64), уровень АТ к кишечной палочке, Аг коклюшного возбудителя, дифтерии, столбняка, поскольку подавляющее большинство людей иммунизировано данными Аг в плановом порядке, т.е. АТ против указанных Аг должны быть у всех.

Для измерения функции системы фагоцитоза изучается микробоцидная способность, фагоцитарная активность, подвижность моноцитов и гранулярных лейкоцитов (гранулоцитов). Метаболическая способность определяется косвенным путем в тесте восстановления нитросинего тетразолия, используя спонтанную и индуцированную реакции.

Кислородный метаболизм фагоцитов также изучают методом хемилюминесценции, который обусловлен генерацией Н2О2 и супероксидного радикала и прямо коррелирует с киллерной способностью клетки. Применяющиеся методы позволяют определить непосредственно кислородный метаболизм, образование различных активных кислородных радикалов индивидуальными клетками. Последний анализ может выполняться на проточном цитофлуориметре.

Поглотительные возможности определяют в реакции фагоцитоза указанных клеток каких-либо объектов: бактерий, дрожжевых клеток, частиц латекса, зимозана и т.д. Подсчитывается процент фагоцитирующмх лейкоцитов и фагоцитарный индекс, т.е. среднее число поглощенных одним фагоцитом частиц при подсчете 100 клеток.

Для оценки функциональных резервов фагоцитирующих клеток использовали фагоцитарную реакцию с определением фагоцитарного показателя и фагоцитарного числа. Для определения переваривающей способности клеток реакцию учитывали через 30 мин и через 2 ч. В качестве стимулятора in vitro использовали продигиозан.

Киллерная способность фагоцитов может быть определена непосредственно по киллингу живых дрожжей, который оценивается с помощью красителя акридинового оранжевого, применяются и специальные красители, позволяющие определить киллинг бактерий отдельными фагоцитами на проточном цитофлуориметре.

Подвижность фагоцитов, в частности, нейтрофильных гранулоцитов или моноцитов периферической крови, измеряется либо по величине спонтанной миграции из капилляров за определенный промежуток времени, либо по измерению этой реакции в присутствии веществ, обладающих хемотаксическим действием.

Анализируются также адгезия на поверхность или их агрегация, четко отражающие функциональную активность клеток, в том числе обусловливаемую молекулами адгезии.

Определение рецепторов на нейтрофилах или моноцитах также проводится для оценки функциональной активности фагоцитарной системы.

Оценка системы комплемента производится в гемолитической системе, состоящей из эритроцитов барана со специфической антисывороткой к ним. Сыворотку предварительно прогревают при 560С в течение 30 мин для разрушения собственного комплемента, а затем добавляют ее в исследуемую сыворотку как источник АТ. Рассчитывается 50% гемолиз, содержание комплемента выражают в единицах СН50 (единица активности, за которую принимают количество комплемента, вызывающее 50% лизис определенного количества сенсибилизированных специфическими АТ эритроцитов).

Количественное определение компонентов комплемента и ингибиторов проводится иммунохимическим методом с использованием моноспецифических анти-сывороток по методу Манчини или в системе, где отсутствует определенный компонент системы комплемента, а остальные ее компоненты присутствуют в избытке.

Активность киллерных клеток измеряется в пробах с мишенями, меченными радиоактивными изотопами, которые выделяются в культурную среду после разрушения клеток киллером.

Специфические методы оценки иммунного статуса (рис. 9).

Таблица 7. Сравнительная характеристика чувствительности методов выявления антител (по Р. Петрову, 1982)

Рис. 9. Специфические методы оценки иммунного статуса

К ним относят иммунофлуоресценцию - использование АТ, меченных иммунофлуоресцирующим красителем, например, флуоресцеином изотиоцианатом, родамином и др. С их помощью обнаруживают места локализации Аг. В ультрафиолетовом свете они хорошо видны.

При радиоиммунном методе используют меченные радионуклидами I131 или I125 (радиоизотопы йода) АТ или Аг. Применяют стандартное количество антисыворотки, связывающей 70-80% меченого Аг. Затем в реагирующую систему вносят искомый немеченый Аг. Он конкурирует с меченым за АТ. Суммарная радиоактивность реагирующей системы падает. Чем больше немеченого Аг в системе, тем в большей степени снижается ее радиоактивность, которую можно измерить, и по полученным данным определить содержание искомого (немеченого) Аг в исследуемой смеси.

Иммуноферментный анализ (ИФА) чувствителен и достаточно прост. Реакцию обычно ставят в пластиковых планшетах, к стенкам их лунок фиксируют АТ к Аг, который следует обнаружить в материале; в другой модификации можно использовать маркерный Аг. Далее вносится исследуемый субстрат, содержащий искомый Аг. Он соединяется с АТ, образуя комплекс Аг-АТ. Не прореагировавший исследуе-

мый субстрат удаляют и вместо него вносят АТ, меченные каким-либо ферментом, например, пероксидазой хрена. Они присоединяются к комплексу Аг-АТ, адсорбированному на полистироле лунки. Далее в систему вносят вещество, дающее цветную реакцию в присутствии пероксидазы хрена. По интенсивности окрашивания количественно оценивается реакция.

YAmedik.org