ГЕНЫ ИММУНОГЛОБУЛИНОВ

ГЕНЫ ИММУНОГЛОБУЛИНОВ

Зародышевые гены иммуноглобулинов. У здорового человека В-лимфоциты в течение жизни создают несколько миллионов вариантов антител, связывающих разные антигены (потенциально 1016 антигенов). Никакой геном физически не несёт столько различных структурных генов. Количество наследуемого от родителей генетического материала (ДНК), определяющего биосинтез антител, не так уж и велико - немногим более 120 структурных генов. Это наследуемое множество генов - зародышевые гены иммуноглобулинов (зародышевая конфигурация генов).

Гены вариабельных доменов

Во всех соматических клетках, включая СКК, гены иммуноглобулинов находятся именно в зародышевой конфигурации, где гены

V-участков представлены в виде отдельных сегментов, расположенных друг относительно друга на значительном расстоянии и сгруппированных в несколько кластеров: собственно V (вариабельный), J (связующий), а у тяжёлых цепей также D (от англ. Diversity - разнообразие). Формирование разнообразия генов для миллионов вариантов V-участков молекул иммуноглобулинов продолжается в течение всей жизни. Оно происходит в процессе дифференцировки B-лимфоцитов и является запрограммированно случайным. В его основе лежат сразу несколько механизмов, свойственных только генам антигенсвязывающих молекул (иммуноглобулин, TCR): рекомбинация зародышевых сегментов, неточность связей между V-, D- и J-сегментами, соматический гипермутагенез, комбинаторика тяжёлых и лёгких цепей в случае В-лимфоцитов или разных цепей TCR. Характеристика V-генов антигенраспознающих структур человека представлена на рис. 5-4.

Рис. 5-4. Характеристика V-генов антигенраспознающих структур человека. Представлены основные характеристики семи известных типов вариабельных генов, определяющих формирование антигенраспознающих структур лимфоцитов. В строке «Вариабельный (V)» указано число зародышевых V-генов соответствующих типов; в скобках отмечено число функционирующих генов (остальные - псевдогены). В соответствующих строках выделено число сегментов D (где они есть) и J, участвующих в формировании зрелого V-гена. Указан размер участка на соответствующих хромосомах, занимаемый сегментами, из которых в процессе реаранжировки формируется зрелый V-ген

Соматическая рекомбинация. На самом раннем этапе дифференцировки лимфоцитов начинается сложный генетический процесс объединения сегментов ДНК, кодирующих разные части антигенсвязывающих молекул - V- и C-домены. В непрерывную последовательность ДНК соединяются по одному сегменту из V-, D- и J-областей, при этом в каждом отдельном B-лимфоците возникает уникальная комбинация VDJ для тяжёлой цепи и VJ - для лёгкой. ДНК из промежутков, содержащих незадействованные зародышевые гены, выбрасывается из генома в виде кольцевых структур.

- Число возможных комбинаций можно подсчитать. Для к-цепи из 35 V-сегментов и 5 J-сегментов может получиться 35x5=175 вариантов V-области; для λ-цепи - 32x4=128 вариантов; всего для лёгких цепей 303 варианта; для тяжёлой цепи 45Vx23Dx6J=6210 вариантов антигенсвязывающих областей. В целой молекуле иммуноглобулина разные лёгкие и тяжёлые цепи объединяются в тетрамер также случайным образом (по крайней мере, теоретически). Число случайных сочетаний из 303 и 6210 - около 1,9x106.

- Рекомбиназы. Рекомбинацию ДНК генов иммуноглобулинов катализируют специальные ферменты - рекомбиназы RAG-1 и RAG-2 (Recombinase Activation Gene - активирующий рекомбинацию ген). Они же катализируют рекомбинацию ДНК генов TCR в T-лимфоцитах, т.е. рекомбиназы - уникальные ферменты лимфоцитов. Однако в B-лимфоцитах эти ферменты не «трогают» гены TCR, а в T-лимфоцитах «обходят» гены иммуноглобулинов. Следовательно, до начала процесса перестройки ДНК в клетке уже существуют регуляторные белки, различные у T- и B-лимфоцитов.

Рекомбинационный комплекс представлен на рис. 5-5.

Сигналом к перестройке V-генов антигенраспознающих рецепторов В- и Т-клеток служит экспрессия генов рекомбинационного комплекса, обеспечивающего основные события на уровне перестраиваемых V-генов и прилегающих генетических сегментов. Комплекс включает ферменты, катализирующие одно- и двунитевые разрывы ДНК, их сшивание, нематричную достройку свободных концов нитей ДНК, а также белки, способствующие сближению пространственно разъединённых фрагментов ДНК. Включение экспрессии генов рекомбинационного комплекса обусловлено действием дифференцировочных факторов.

Рис. 5-5. Рекомбинационный комплекс

Процесс реаранжировки начинается с экспрессии рекомбиназ RAG-1 и RAG-2. Рекомбиназы присоединяются рядом с сегментами, которым предстоит войти в состав зрелого V-гена. Затем они димеризуются, что приводит к формированию петли. После этого происходят разрывы двунитевой ДНК между сайтом связывания фермента и соответствующим сегментом. Свободные концы нитей сшиваются при участии ДНК-лигазы IV с образованием шпильки. Затем под влиянием эндонуклеазы Artemis происходит повторный разрыв нити ДНК в шпильке и попарное воссоединение (лигирование) нитей двуспиральной ДНК как в сегментах, которые войдут в состав зрелого V-гена (информационная последовательность), так и в удаляемом участке (сигнальная последовательность). Это становится возможным благодаря «подтягиванию» друг к другу ранее разъединённых участков ДНК, которое происходит с участием димера Ku70/Ku86 (Ku86 также называют Ku80). Этот процесс («разрешение» шпильки) происходит с участием ДНК-зависимой протеинкиназы DNA-PKcs. В результате формируется зрелый V-ген и сигнальное кольцо (рис. 5-6, 5-7).

Реаранжировка V-генов антигенраспознающих структур сопровождается сближением генетических сегментов. Этот процесс обеспечивается определённой организацией пространства между V-генами и

Рис. 5-6. Роль рекомбиназ RAG-1 и RAG-2 в начальных событиях перестройки V-генов

генетическими сегментами (J, D). Справа (с З'-конца) ко всем V-генам примыкают три участка ДНК со строго детерминированной последовательностью: гептамер (состава 5'CACAGTG3'), спейсер, состоящий из 23 пар оснований, и нонамер (состава 5'ACAAAAACC3'). К J-сегменту слева (с 5'-конца) примыкает гептамер, далее (влево) следует спейсер, содержащий 12 пар оснований, и нонамер. В случае генов, кодирующих Н- и λ-цепи, к гептамеру при V-гене примыкает спейсер, содержащий 23 пары оснований, а к гептамеру соединительных сегментов (J в случае λ-цепи, D в случае Н-цепи) - спейсер, содержащий 12 пар оснований. Для гена к-цепи характерно противоположное расположение 23- и 12-членных спейсеров, отражающих последовательности сегментов: для к-цепи - 7-12-9 - 9-23-7, для λ-цепи - 7-23-9 - 9-12-7. В случае генов Н-цепи ситуация усложняется наличием трёх генов/сегментов, подлежащих соединению (V-D-J). В этом случае цифровое правило принимает вид: 7-23-9 - 9-12-7 - 7-12-9 - 9-23-7. На

рис. 5-6 воспроизведена перестройка гена λ-цепи. При формировании петли гептамеры, прилегающие к V-гену и соединительным сегментам, узнают друг друга и взаимодействуют по принципу комплементарности, поскольку они представляют палиндромы, т.е. последовательности, читаемые от З'-конца и от 5'-конца, комплементарные друг другу, например CACAGTG и GTGACAC. То же можно сказать и о нонамерах. В результате такого взаимодействия сегменты, которые не войдут в состав зрелого V-гена, включаются в петлю и удаляются в составе сигнального кольца, а избранные V- и J-сегменты оказываются сближенными и образуют зрелый V-ген.

Неточность связи V-D-J. Под неточностью связей сегментов V, D и J понимают тот факт, что при их формировании происходит добавление лишних нуклеотидов. Выделяют 2 типа таких нуклеотидов: P- и N-нуклеотиды.

- Нуклеотиды P (от англ. Palindromic sequences - зеркальные последовательности) возникают на концах каждого из сегментов, вовлечённых в рекомбинацию, при вырезании одноцепочечных

Рис. 5-7. Образование P- и N-вставок при реаранжировке V-генов

петель ДНК (шпилек) и «достройке хвостов» ферментами репарации ДНК.

Нуклеотиды N (от англ. Nontemplate-encoded - нематрично кодируемые), характерны только для тяжёлых цепей, случайным образом пристраиваются к концам V-, D- и J-сегментов специальным ферментом - терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазой (TdT).

- С учётом присоединения N- и P-нуклеотидов число вариантов антигенсвязывающих областей целых молекул иммуноглобулинов составляет порядка 1013. Если учесть аллельные варианты V-, D- и J-сегментов, то теоретически разнообразие составит около 1016 (в действительности это значение меньше, поскольку в организме нет такого числа лимфоцитов).

- В 2/3 случаев «платой» за попытки увеличить разнообразие антигенсвязывающих областей антител служит непродуктивная рекомбинация генов, т.е. сдвиг рамки считывания или генерация стоп-кодонов, делающие невозможной трансляцию белка.

• Гипермутагенез - запланированное повышение частоты точечных мутаций - отличает гены иммуноглобулинов даже от генов TCR. Гипермутагенез происходит только в В-лимфоцитах во время иммуногенеза (т.е. после состоявшегося распознавания антигена и начавшегося иммунного ответа) в зародышевых центрах лимфоидных фолликулов периферических лимфоидных органов и тканей (лимфатических узлов, селёзенки, диффузных скоплений). Частота точечных мутаций в V-генах иммуноглобулинов достигает 1-го нуклеотида из 1000 на 1 митоз (т.е. каждый второй В-лимфоцит клона в зародышевом центре приобретает точечную мутацию в V-гене иммуноглобулинов), тогда как для всей остальной ДНК она на 9 порядков ниже.

Гены константных доменов

Структурные гены константных доменов полипептидных цепей иммуноглобулинов расположены в тех же хромосомах, что и V-, D- и J-гены, к 3'-концу от J-сегментов.

• Лёгкая цепь (рис. 5-8). Для лёгких к-цепей существует один C-ген - Ск, а для λ-цепей (на рисунке не показаны) - 4 или 5 (в зависимости от гаплотипа) - Сλ1,2,3,6,7. «Стыковка» нуклеотидного кода для V- и C-доменов лёгких цепей происходит на уровне не ДНК, а РНК - по механизму сплайсинга первичного транскрипта РНК.

Рис. 5-8. Структура генов и синтез белка κ-лёгкой (L) цепи иммуноглобулинов человека

Тяжёлая цепь (рис. 5-9) каждого изотипа иммуноглобулинов также кодируется отдельным C-геном. У человека такие гены расположены в следующем порядке, считая от J-сегмента к З'-концу: Сμ, Сδ, СγЗ, Сγ1, ψСε (псевдоген ε-цепи), Cα1, Cγ2, Cγ4, Сε, Сα2. Завершившие лимфопоэз B-лимфоциты, независимо от специфичности их BCR, экспрессируют иммуноглобулины только классов IgM и IgD. При этом мРНК транскрибируется в виде непрерывного первич-

Рис. 5-9. Структура генов тяжёлой (Н) цепи иммуноглобулинов человека

ного транскрипта с перестроенных генов VDJ и Сμ/Cδ. ДНК C-генов других изотипов остаётся нетронутой. В результате альтернативного сплайсинга первичного транскрипта образуются мРНК отдельно для тяжёлых цепей IgM и IgD, которые и транслируются в белок. Этим процессом заканчивается полноценный лимфопоэз B-клеток.

Переключение изотипов иммуноглобулинов

В процессе развития иммунного ответа, т.е. после распознавания антигена и под действием определённых цитокинов и молекул клеточной мембраны T-лимфоцитов, может происходить переключение синтеза иммуноглобулинов на другие изотипы - IgG, IgE, IgA (рис. 5-10).

• Переключение изотипа тяжёлой цепи тоже идёт по механизму рекомбинации ДНК: к ранее перестроенной комбинации VDJ присоединяется один из C-генов тяжёлой цепи (либо Сγ1, либо Сγ2, либо Сγ3, либо Сγ4, либо Сε, либо Сα1, либо Сα2). При этом происходит разрыв ДНК по областям переключения - SR (Switch Region), расположенным в интронах перед каждым C-геном (за исключением Сδ).

• ДНК C-генов, предшествующих задействованному (расположенных на 5'-конце от него), элиминируется в виде кольцевых структур, поэтому дальнейшее переключение изотипа возможно только по направлению к 3'-концу.

• Установлено, что гипермутагенез и переключение изотипов иммуноглобулинов катализируются ферментом AID (Activation Induced Cytidine Deaminase - цитидиндезаминаза, индуцируемая активацией). Этот фермент специфически атакует экспрессированные гены иммуноглобулинов и отщепляет аминогруппы от цитидиновых оснований, которыми богата ДНК этих генов. В результате этого цитозины преобразуются в урацилы, которые распознаются и вырезаются ферментами репарации ДНК. Последующая цепочка каталитических реакций с участием более чем десяти различных белков (эндонуклеаз, фосфатаз, полимераз, гистонов и т.п.) приво-

Рис. 5-10. Рекомбинация ДНК при переключении изотипов иммуноглобулинов B-лимфоцитов

дит к появлению мутаций (в случае гипермутагенеза) или двуцепочечных разрывов ДНК по областям переключения изотипов.

YAmedik.org