МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ВНУТРИКЛЕТОЧНЫХ ЦИТОПЛАЗМАТИЧЕСКИХ И ЯДЕРНЫХ БЕЛКОВ - ФАКТОРОВ ТРАНСКРИПЦИИ, СИГНАЛЬНЫХ МОЛЕКУЛ И ДРУГИХ

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ВНУТРИКЛЕТОЧНЫХ ЦИТОПЛАЗМАТИЧЕСКИХ И ЯДЕРНЫХ БЕЛКОВ - ФАКТОРОВ ТРАНСКРИПЦИИ, СИГНАЛЬНЫХ МОЛЕКУЛ И ДРУГИХ

Методы твердофазных иммуноанализов типа ELISA используют и для изучения молекулярных процессов проведения сигналов от мембранных рецепторов внутрь клетки. Эксперименты такого типа состоят из двух этапов.

Творческий поисковый этап - создание модели активации определенных живых клеток in vivo или в культуре in vitro.

Технический этап:

а) лизис клеток без денатурации макромолекул;

б) детекция искомых молекул передачи сигналов методом ловушечного ИФА.

В качестве «ловушки» на твердой фазе используют высокоспецифичные антитела к определенным эпитопам, характерным для активированного состояния молекул, например сайтам фосфорилирования конкретных белков, участвующих в проведении сигнала. В этой связи коммерческие тест-системы такого назначения получили название «phosphoELISA».

Внутриклеточные белки исследуют в целях анализа конкретных молекулярных путей проведения сигналов в клетке (англ. pathways - путь), определяя конкретные киназы, фосфатазы, адаптерные белки, факторы транскрипции и др.

Для исследования внутриклеточных цитоплазматических белков и их производных интересующие клетки тщательно отмывают от внеклеточных субстанций 2-3-кратным центрифугированием (800 g, 5-6 мин) в фосфатном солевом буферном растворе, после чего лизируют буфером следующего состава (одного из возможных): 50 mM Tris, pH 7,4; 250 mM NaCl; 5 mM EDTA (этилендиаминтетраацетат); 1% NP40 (Nonidet P40); 50 mM NaF; 1mM Na3VO4; 1 mM PMSF (ингибитор сериновых протеаз - трипсина и химотрипсина - фенилметан-сульфонил флюорид, матричный 0,3 М раствор в ДМСО, добавляют ex temporo); смесь ингибиторов протеаз (AEBSF, пепстатин А, Е-64, бестатин, лейпептин, апротинин или других, добавляют ex temporo).

Осадок отмытых фосфатным буфером клеток ресуспендируют в лизирующем буфере и оставляют на 15 мин в условиях мягкого перемешивания. Затем лизат центрифугируют при 14 000 об/мин в течение 10 мин, разливают по аликвотам, определяют в нем общую концентрацию белков (чаще всего - методом Bradford). Наиболее приемлемы для дальнейших анализов концентрации белков 200- 400 мкг/мл.

В дальнейшем выполняют обычный ловушечный вариант ELISA (см. выше). Весьма важен как можно более многосторонний контроль (как минимум заведомо положительный контроль, заведомо отрицательный контроль, а также лизат одноименных, но неактивированных клеток, лизат клеток, обработанных «посторонним» биохимически родственным активатору веществом и др.).

Определение факторов транскрипции во внутриядерном содержимом

Процедура получения фракции ядер интересующих клеток может быть следующей.

1. 5х106-2х107 клеток помещают в коническую пробирку объемом 15 мл, дважды отмывают в 10 мл фосфатно-солевого буфера (ФСБ) при 800 g 5-6 мин.

2. Супернатант удаляют и к осадку клеток добавляют гипотонический лизирующий буфер из расчета 0,5 мл буфера на 5х106 клеток. Ex temporo (не ранее, чем за 10 мин до добавления к клеткам) на 0,5 мл гипотонического буфера добавляют 5 мкл ингибиторов фосфатаз, 5 мкл ингибиторов протеаз, 5 мкл DTT (дитиотреитол), 0,5 мкл

PMSF.

3. Клетки аккуратно перемешивают в гипотоническом буфере, переносят в чистую пробирку объемом 1,5 мл и оставляют на льду в течение 10 мин.

4. Добавляют 25 мкл на 0,5 мл рабочего материала раствора детергента (0,1% SDS; 1% Triton X-100; 0,1% Tween 20) и перемешивают в течение 5 с.

5. Центрифугируют при 800 g 5-6 мин, 4 °С.

6. Супернатант отделяют (он содержит цитоплазматические белки и может представлять интерес для отдельного анализа), а осадок ядер ресуспендируют в 1 мл полного буфера для отмывки ядер (к буферу добавляют ex temporo 10 мкл ингибиторов фосфатаз, 10 мкл ингибиторов протеаз, 10 мкл раствора DTT, 1 мкл раствора PMSF).

7. Ядра дважды отмывают центрифугированием при 800 g 5-6 мин, 4 °С.

8. Осадок ядер по объему примерно равен 25 мкл. К этому осадку добавляют равный объем специальных экстрагирующих буферов и аккуратно перемешивают в течение 2 с.

9. Смесь инкубируют на льду в течение 30 мин, перемешивая каждые 10 мин.

10. Осветляют ядерный экстракт центрифугированием при 14 000 g 30 мин при 4 °С.

11. Супернатант содержит искомые вещества (факторы транскрипции). Его переносят в чистые охлажденные пробирки.

12. Определяют концентрацию белков по Bredford. Как правило, из 5х106 клеток удается получить 25-100 мкг ядерных белков.

13. Полученные образцы можно морозить при -80 °С в ожидании анализа, но только однократно.

Существуют технологии одновременного определения в одном биоматериале нескольких искомых факторов транскрипции (или цитокинов, или киназ и др.). Подобные методы в настоящее время осуществимы главным образом с применением высокотехнологичных коммерческих тест-систем. В качестве примера мы приведем описание процедур для тест-системы «Luminex 100» (Invitrogen. www.invitrogen.com). В данной технологии в качестве твердой фазы для ключевых реагентов используют микрошарики. Оценка результатов возможна только на уникальном приборе (большинство подобных тест-систем - так называемые закрытые, т.е. используют только свои приборы, свои реагенты, свои компьютерные программы).

Факторы транскрипции по своей природе реагируют, т.е. специфически связываются с определенными последовательностями нуклеотидов в двуспиральной ДНК.

Поэтому специфическими реагентами на факторы транскрипции являются строго определенные олигонуклеотиды ДНК, меченные биотином.

Второй олигонуклеотидный реагент конструируют из двух частей. Первая - последовательность нуклеотидов, комплементарная меченному биотином олигонуклеотиду. В виде двойной спирали они составляют сайт связывания искомого фактора транскрипции. Вторая часть этого олигонуклеотида - «ловушечная» последовательность, комплементарная последовательности нуклеотидов, фиксированной на твердой фазе (микрошариках).

Пробы раскапывают в лунки микропланшет, предназначенных для проведения ПЦР, чтобы использовать для инкубаций в качестве термостата термоциклер.

Минимальный набор анализируемых образцов включает:

•  заведомо позитивный контроль;

•  заведомо негативный контроль;

•  пробу в виде постороннего белка;

•  ядерный экстракт из нестимулированных клеток;

•  ядерный экстракт из одноименных стимулированных клеток. Такой планшет инкубируют в течение 20 мин при 25 °С (можно в

ПЦР-термоциклере, который в данном случае используют как удобный динамичный термостат).

Затем в лунки с позитивным контрольным реагентом добавляют только буфер, тогда как в остальные лунки вносят буфер с нуклеазой, расщепляющей не связанную с белками ДНК. Инкубируют 20 мин при 37 °С. Только те ДНК-пробы, с которыми связались факторы транскрипции, не расщепляются нуклеазой, так как факторы транскрипции защищают последовательность нуклеотидов от атаки нуклеазы. Таким образом, количество биотиновой метки на молекулах ДНК прямо коррелирует с количеством того или иного фактора транскрипции в биопробе.

Стадия гибридизации с твердой фазой: в лунки вносят реагентные микрошарики и инкубируют 45 мин при комнатной температуре под светонепроницаемой крышкой, например, из алюминиевой фольги (рис. 4.14).

Рис. 4.14. Связывание с твердой фазой (шариками)

На следующей стадии (отмывке) применяют специальные планшеты из фильтрующего материала: содержимое лунок первоначальных планшет переносят в лунки планшет из фильтрующего материала и промывают трижды промывочным буфером с использованием вакуумной аспирации; растворимые компоненты вымываются, микрошарики остаются на дне лунок фильтровальных планшет.

Добавляют проявляющий реагент - конъюгат стрептавидина с люминофором, инкубируют 5 мин в темноте (рис. 4.15). Промывают и регистрируют люминесценцию на специальном приборе (например, Luminex 100).

Результаты считывают и обрабатывают специальной компьютерной программой (Luminex IS и др.).

В каждой биопробе за один цикл анализа, т.е. одновременно, можно количественно определить до 10 факторов транскрипции и более.

Рис. 4.15. Проявка

Вопросы и задания

1. Дайте определение термина «иммуноанализы».

2. Назовите варианты меток.

3. Назовите технологические варианты иммуноанализов.

4. Что такое «прямые» иммуноанализы?

5. Что такое «непрямые» иммуноанализы?

6. Какие вам известны варианты конструкций тест-систем?

7. Какие ферменты используют в иммуноферментных анализах?

8. Что такое иммунохроматография?

9. Что такое иммуноблот?

10. Дайте определение чувствительности и специфичности тестсистем.

11. Тест-системы с какими чувствительностью и специфичностью (высокой/низкой) следует применять в скрининговых (первичных) обследованиях?

12. Как зависит величина сигнала от концентрации определяемого вещества в биопробе в:

а) ловушечном;

б) конкурентном;

в) ингибиторном;

г) «сэндвич»;

д) иммунометрическом вариантах иммуноанализов.

13. Нарисуйте схему иммунометрической тест-системы.

14. Что означает вывод о «ложнопозитивном» результате иммуноанализа?

15. Что означает вывод о «ложнонегативном» результате иммуноанализа?

16. Какие варианты регистрирующих приборов применяют в иммуноанализах?

17. Какова в среднем чувствительность иммуноанализов (относительно концентраций определяемых веществ)?

YAmedik.org