АНАЛИТИЧЕСКАЯ И ПРЕПАРАТИВНАЯ ЦИТОФЛУОРИМЕТРИЯ

АНАЛИТИЧЕСКАЯ И ПРЕПАРАТИВНАЯ ЦИТОФЛУОРИМЕТРИЯ

Метод проточной цитофлуориметрии, предложенный в начале 1970-х годов, широко используется в медико-биологических и клинических исследованиях. Востребованность цитометрии объясняется быстротой, точностью и надежностью метода. Определение фенотипа каждой клетки в сочетании с анализом большого количества событий дает максимально полную информацию в кратчайшие сроки.

Принцип метода. Используются проточные цитометры разных фирм. При проведении исследования клетки, окрашенные тем или иным флуоресцентным красителем, вводят с потоком буферного раствора в вибрирующую проточную камеру с форсункой. В каждой капле жидкости, выходящей из форсунки, содержится одна клетка. Источник света (чаще всего лазер) освещает отдельные клетки в проходящей через световой пучок тонкой струе жидкости. Исходный световой луч рассеивается клеткой. Это рассеяние измеряется с помощью фотоэлектронного умножителя (ФЭУ). Рассеяние света под малыми углами (переднее рассеяние - forward scatter) может быть использовано для определения размеров клетки. На основе данного параме-

тра можно отличить жизнеспособные ядерные клетки от мертвых и эритроцитов. Рассеяние света под углом 90° (боковое рассеяние - side scatter) позволяет судить о соотношении размеров ядра и цитоплазмы и наличии гранул в клетке. Полученные характеристики позволяют разделить анализируемые лейкоциты на лимфоциты, моноциты, нейтрофилы. Одновременно можно проводить анализ поверхностных и внутриклеточных антигенов клеток с помощью моноклональных антител к ним, конъюгированных с различными флуоресцентными метками. Если анализируемая клетка содержит флуорохром, то он испускает излучение соответствующих параметров, при этом интенсивность флуоресценции коррелирует с плотностью антигена на клеточной поверхности, а уровень флуоресценции измеряется с помощью ФЭУ (рис. 2.4, см. также цв. вклейку).

В практике широко используются два флуоресцентных красителя - флуоресцеин-5-изотиоционат (ФИТЦ) и R-фикоэритрин (ФЭ). Они возбуждаются аргоновым лазером с длиной волны 488 нм и излучают флуоресценцию в разных диапазонах волн: ФИТЦ излучает свет в «зеленом» спектре, а ФЭ - в «оранжево-красном». Красители различаются как по специфичности их молекулярного связывания, так и по оптическим характеристикам, таким, как спектр поглощения, возбуждение флуоресценции и др. В настоящее время спектр используемых флуорохромов расширился (табл. 2.1).

Таблица 2.1. Основные используемые флуорохромы

Окончание табл. 2.1

Проточный цитометр включает три основных блока:

1) оптический, где производится измерение;

2) блок обработки сигналов, где сигналы усиливаются и преобразуются в электрические;

3) блок сбора и обработки данных (см. рис. 2.4).

Оптические системы

Источником света обычно служит лазер. Он способен направить на клетку интенсивный световой сигнал и создать чувствительную систему детекции.

Световой сигнал проходит через соответствующие линзы и зеркала и попадает на ФЭУ. На этой стадии передачи сигнала используются

оптические фильтры для выделения света с определенной длиной волны, благодаря чему на каждый детектор попадает только избранный тип светового сигнала, например зеленое или красное излучение клеток при флуоресценции или рассеянный свет. Оптический блок предназначен для измерения рассеяния света и флуоресценции. Современные цитометры оборудованы несколькими фотоэлектронными умножителями, что позволяет одновременно регистрировать несколько типов флуоресценции.

Рис. 2.4. Устройство проточного цитометра

Система сбора и обработки данных

Сигналы, поступающие от детекторов, усиливаются, их амплитуды измеряются и анализируются в цифровой форме для каждой клетки отдельно. Ограничения, накладываемые на регистрируемый параметр, называются окнами («gate»). Окна выделяются автоматически или вручную (рис. 2.5, см. также цв. вклейку). Результаты анализа используются для построения распределений исследованных клеток по их характеристикам. Эти распределения называют гистограммами.

Рис. 2.5. Выделение окон лимфоцитов, моноцитов, нейтрофилов по светорассеянию

Применение метода проточной цитометрии

Рис. 2.6. Проточный цитофлуориметр

Современные проточные цитометры обладают высокой чувствительностью, высоким уровнем автоматизации, просты в эксплуатации, имеют небольшие размеры (рис. 2.6, см. также цв. вклейку). Проточная цитометрия стала незаменимым методом диагностики различных иммунопатологических состояний в клинической практике: успешно используется в гематологических лабораториях, для оценки иммунного статуса, в онкологии. Метод позволяет:

•  проводить иммунофенотипирование клеток: дифференцировать популяции лейкоцитов, определять субпопуляционный состав лимфоцитов;

•  оценивать функциональную активность клеток;

•  проводить анализ клеточного цикла и плоидности клеток;

•  проводить анализ программируемой клеточной гибели (апоптоза);

•  определять внутриклеточные и растворимые формы цитокинов;

•  оценивать фагоцитарную активность клеток;

•  проводить анализ биологических жидкостей (секреты, слюна и др.);

•  проводить количественное и качественное исследование pH, концентрации свободных ионов кальция, уровня окислительных процессов;

•  осуществлять мониторинг иммунодефицитных состояний, проводить онкогематологические исследования.

Количественное определение субпопуляций лимфоцитов с помощью проточной лазерной цитометрии с использованием моноклональных антител

Фенотипирование лимфоцитов широко применяется в клинической иммунологии. В основе метода лежит взаимодействие моноклональных антител, меченных флуоресцентной меткой, с поверхностными антигенами лимфоцитов и последующий анализ образцов на проточном цитометре. Возможно использование одного моноклонального антитела, меченного флуорохромом, или двух различающихся по специфичности моноклональных антител, меченных разными флуорохромами (рис. 2.7). Определяют процент клеток, несущих на своей поверхности искомый антиген, и среднюю интенсивность свечения, которая характеризует выраженность экспрессии исследуемого антигена. Для проведения исследования можно использовать как цельную кровь, так и предварительно выделенные

из периферической крови обследуемого лейкоциты или мононуклеарные клетки. Разработаны многоцветовые цитометры.

Рис. 2.7. Дот-анализ: двойное окрашивание по CD3 и CD4

Лабораторная работа 2-3

1. Получают гепаринизированную периферическую венозную кровь (20-25 ЕД гепарина на 1 мл крови) в объеме 5 мл.

2. Лейкоциты выделяют из периферической крови. Для этого добавляют в пробирку 0,3% раствор желатины, перемешивают и инкубируют в термостате 30 мин при 37 °С для осаждения эритроцитов. Собирают лейкомассу. Клетки отмывают полной культуральной средой, центрифугируя при 1000 об/мин в течение 10 мин. Процедуру отмывки проводят дважды.

3. К клеточному осадку добавляют 50 мкл полной культуральной среды. Затем в каждую пробирку вносят по 50 мкл предварительно разведенного образца нужных моноклональных антител (монАТ), меченных флуорохромами. Одна пробирка (контроль) содержит только клетки и полную культуральную среду.В остальные пробирки добавляют монАТ - CD3, CD4, CD8, CD19 и другие в зависимости от цели эксперимента.

4. Пробирки инкубируют 30 мин при 4 °С.

5. Клетки отмывают от излишних монАТ в полной культуральной среде центрифугированием при 1000 об/мин в течение 5 мин.

6. Оставшиеся в пробе эритроциты лизируют, добавляя к клеточному осадку лизирующий раствор, состоящий из 0,8% раствора NH4Cl, 0,1% раствора NaHCO3, 0,0037% натриевой соли ЭДТА (рН = 7,2-7,4).

7. Проводят встряхивание проб на шейкере 1 мин.

8. Образцы центрифугируют 5 мин при 1000 об/мин. Надосадочную жидкость сливают, добавляют полную культуральную среду и повторяют центрифугирование в том же режиме.

9. Для фиксации меченых клеток в каждую пробу добавляют по 100 мкл 2% параформальдегида и инкубируют 30 мин при 4 °С.

10. Анализ образцов проводят на проточном цитометре. Содержание основных субпопуляций лимфоцитов в периферической крови здоровых людей представлено в табл. 2.2.

Выделение клеток методом проточной цитометрии

На основе параметров, измеряемых с помощью проточной цитометрии, можно проводить сепарацию клеток. Проанализированные клетки перемещаются в каплю, которой придается положительный/ отрицательный заряд, или в нейтральную каплю (процесс контро-

лируется компьютерной программой). Капли с флуоресцирующими клетками заряжаются положительно, а с нефлуоресцирующими - отрицательно. Капля проходит между противоположно заряженными электродами и отклоняется вправо или влево в зависимости от своего заряда. Уровень чистоты клеточных фракций, разделенных с помощью клеточного сортера, доходит до 99%.

Таблица 2.2. Содержание основных субпопуляций лимфоцитов в периферической крови здоровых людей разного возраста

YAmedik.org