ВЫДЕЛЕНИЕ НЕЙТРОФИЛОВ

ВЫДЕЛЕНИЕ НЕЙТРОФИЛОВ

Для выделения нейтрофилов из периферической крови можно использовать несколько методов.

Выделение нейтрофилов в двойном градиенте плотности фиколл-урографина

Принцип метода. Для предотвращения активации нейтрофилов во время выделения рекомендуется проводить все манипуляции при 4 °C. Используют фиколл-урографин ρ = 1,077 г/см3 и ρ = 1,119 г/см3. Вначале создают двойной градиент фиколл-урографина: первым в пробирку вносят раствор фиколл-урографина, имеющий плотность ρ = 1,119 г/см3, затем на него аккуратно наслаивают раствор фиколла с плотностью ρ = 1,077 г/см3. Гепаринизированную кровь наслаивают на двойной градиент фиколл-урографина, центрифугируют 45 мин при 400 g. После центрифугирования получают кольца мононуклеарных клеток (верхнее) и нейтрофилов (нижнее), а в осадке находятся эритроциты. Полученное кольцо мононуклеарных клеток в зависимости от характера эксперимента удаляют или отбирают в чистую центрифужную пробирку и отмывают культуральной средой. Нейтрофильное кольцо отбирают и переносят в чистую пробирку, содержащую среду, свободную от ионов Ca2+ и Mg2+. Клетки дважды отмывают, центрифугируя 10 мин при 200 g. Присутствующие эритроциты можно лизировать. Для уменьшения примеси эритроцитов и повышения доли нейтрофилов нужно вначале проинкубировать гепаринизированую кровь с 6% раствором декстрана и затем полученную взвесь клеток наслоить на двойной градиент фиколл-урографина (получают два кольца клеток, см. выше) или на одинарный градиент плотности фиколл-урографина (ρ = 1,077 г/см3). В последнем случае нейтрофилы присутствуют в осадке вместе с эритроцитами, которые впоследствии лизируют. При использовании обоих вариантов метода содержание нейтрофилов в полученной клеточной суспензии составляет около 95% (рис. 2.3, см. также цв. вклейку).

Выделение нейтрофилов в градиенте плотности перколла

Перколл представляет собой взвесь коллоидных частиц двуокиси кремния, покрытых поливинилпирролидоном, что делает частицы нетоксичными. Обычно коммерческий препарат перколла разбавляют культуральной средой для сохранения изотоничности раствора.

Используют растворы перколла разной концентрации. Вначале на 63% раствор перколла наслаивают 72% раствор перколла, а затем - гепаринизированную кровь. После центрифугирования, кроме кольца мононуклеарных клеток, получают кольцо гранулоцитов и осадок эритроцитов. Кольцо, содержащее гранулоциты, переносят в другую пробирку, клетки отмывают и подсчитывают их число.

Рис. 2.3. Выделение нейтрофилов в двухступенчатом градиенте плотности фиколл-урографина

YAmedik.org