ВЫДЕЛЕНИЕ МОНОЦИТОВ

ВЫДЕЛЕНИЕ МОНОЦИТОВ

Лабораторные методы выделения моноцитов разнообразны, но основные методические приемы преимущественно связаны с фракционированием моноцитов по способности прилипать к стеклу или пластиковой поверхности или по способности при центрифугировании к локализации в определенных зонах ступенчатого градиента.

Выделение моноцитов по способности прилипать к стеклу или пластику

Принцип метода. Моноциты периферической крови человека получают выделением мононуклеарных клеток по методу Воуит с последующим их фракционированием на прилипающие (ПК) и неприлипающие клетки (НПК). Для получения моноцитов мононуклеарные клетки, выделенные в одноступенчатом градиенте фиколлурографина, разделяют на ПК и НПК, используя способность клеток моноцитарно-макрофагального ряда прилипать к стеклу и пластику. Для этого суспензию мононуклеаров в концентрации 2χ106 кл/мл культивируют в среде 199, содержащей 20% сыворотку эмбриона коровы (СЭК), при 37 °С в пластиковых чашках Петри. Через 40 мин собирают НПК, а ПК снимают со дна чашки охлажденным (4-6 °С) раствором Версена, который заливают по 1 мл в чашку сразу после удаления надосадочной жидкости. Через 1-2 мин собирают ПК, помещают в силиконированные центрифужные пробирки и центрифугируют при 200 g в течение 10 мин. Удаляют надосадочную жидкость и ПК ресуспендируют в среде 199 с 10% СЭК.

Метод Рекалде

Принцип метода. Данный метод выделения моноцитов основан на центрифугировании лейкоцитов в гипертоническом градиенте плотности фиколл-урографина (Recalde Н., 1984).

Лабораторная работа 2-2

Постановка метода Рекалде

1. Кровь осторожно перемешивают с 6% раствором декстрана Т-500 («Pharmacia», Швеция), приготовленном на физиологическом растворе из расчета: 1 объем декстрана на 5 объемов крови.

2. Кровь отстаивается в течение 30 мин (15 мин при 37 °С, затем 15 мин при комнатной температуре).

3. Осторожно собирают плазму, обогащенную лейкоцитами (лейкомасса). К полученной лейкомассе трехкратно добавляют раствор NaС1 по следующей схеме:

•  0 мин - добавляют 9% NaС1 из расчета 5 мкл на 1 мл лейкомассы, инкубация 10 мин при 37 °С;

•  11-я минута - добавляют 9% NaС1 из расчета 10 мкл на 1 мл лейкомассы, инкубация 10 мин при 37° С;

•  21-я минута - добавляют 9% ?С1 из расчета 10 мкл на 1 мл лейкомассы, инкубация 10 мин при 37 °С.

Общее время инкубации составляет 30 мин.

4. К лейкомассе добавляют равный объем раствора Хенкса, соответствующей осмомолярности, полученный путем добавления 25 мкл 9% раствора NaС1 на каждый миллилитр стандартного раствора Хенкса.

5. Немедленно проводят выделение моноцитов на гипертоническом градиенте плотности. Для этого в стандартный раствор фиколлурографина добавляют кристаллический NaС1 из расчета 2,8 мг на каждый миллилитр раствора фиколл-урографина (удельная плотность 1,078 г/см3). Конечная плотность раствора составляет 1,080 г/см3. В силиконированные пробирки на один объем гипертонического градиента осторожно наслаивают 3 объема подготовленной лейкомассы.

6. Пробирки центрифугируют в течение 25 мин при 400 g при комнатной температуре в центрифуге с горизонтальным ротором. После центрифугирования моноциты концентрируются в интерфазном кольце.

7. Моноциты из интерфазы переносят в силиконированные пробирки и дважды отмывают средой 199, содержащей 5% СЭК. Режим центрифугирования - 10 мин при 200 g.

8. Клетки ресуспендируют в питательной среде RPMI-1640, содержащей 1% L-глютамина, 40 мкг/мл гентамицина и 10% СЭК. Количество моноцитов определяют подсчетом в камере Горяева. Жизнеспособность клеток оценивают с помощью 0,1% раствора трипанового синего.

YAmedik.org